A－A大鼠模型足腫脹針灸方案優選對局部病理組織中ICAM－1表達的影響

李鑫元，郭榮勝，李元鑫，鄒永艷，徐春梅，周振坤△

(1.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱150086;2.山東省威海市中醫院，山東威海264200;3.黑龍江省中醫研究院，黑龍江哈爾濱150036)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)簡稱類風濕，是一種慢性、系統性及炎癥性疾病，主要累及四肢小關節及某些內臟。過去認為本病屬膠原系統疾病，現已證明類風濕關節炎主要是以對稱性多關節炎為主要臨床表現的異質性系統性疾病，病變的主要位置是關節的滑膜，其次為漿膜，心、肺、血管、神經及眼等結締組織也可廣泛發生的免疫性疾病，病程遷延。

在前期研究中，筆者通過實驗，做了A－A大鼠模型足腫脹針灸方案優選療效的初步觀察。結果證實，針灸治療RA有肯定的臨床療效，能緩解RA的局部癥狀，減輕關節腫脹。

盡管RA是一種全身性的免疫性疾病，而局部病變是RA病的最主要的臨床表現，其基本特征是關節滑膜炎，ICAM－1是最重要的白細胞－內皮細胞間粘附分子之一，介導白細胞與血管內皮細胞之間的粘附及白細胞穿出血管壁這一復雜過程，在炎癥過程中發揮著重要的作用。既然針灸對RA臨床癥狀的改善具有良好的效果，對A－A大鼠的足腫脹度具有明顯的消腫作用，那么，針灸對于RA局部病理變化及ICAM－1的表達有何影響?在此研究基礎上，筆者對針灸治療A－A大鼠模型的療效進行進一步觀察，以A－A的病理形態學變化及局部病理組織中ICAM－1表達為指標，以優選出針灸治療類風濕性關節炎的最佳治療方案。

在本實驗中用氟氏完全佐劑建立了大鼠關節炎模型，許多放射學研究結果一致認為，A－A模型是針對長期病理學改變研究RA的較為理想的動物模型。本研究中，仍以A－A大鼠模型為實驗對象，實驗方法運用正交設計的原理，選用整體取穴、局部取穴和病程為三因素，把火針、艾灸、毫針和對應病程(誘導后3天、7天、14天)列為三水平，從A－A的病理形態學變化及局部病理組織中ICAM－1表達方面對針灸治療A－A大鼠模型的療效進行進一步觀察。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠120只，雌性，體重145～170 g，6～8周齡，合格證號:黑動字P00102005。

1.2 主要實驗試劑及儀器

氟氏完全佐劑(Freund＇s Complete Adjuvant，FCA)美國Sigma公司產品，批號:102k8930，內含0.1%滅活分支桿菌;ICAM－1免疫組化試劑合，批號:BA0541;8%多聚甲醛、EDTA、多聚－L－賴氨酸、磷酸鹽緩沖液(PBS):PH 7.4、檸檬酸緩沖液:0.01M PH 6.0、抗體稀釋液、DAB顯色試劑合;光學顯微鏡(BH－2型)日本Olympus公司;毫針采用華佗牌針灸針，規格0.28 mm×15 mm;艾灸:以艾絨制麥粒大艾柱;火針:賀氏細火針。

2 實驗方法

2.1 模型建立

氟氏完全佐劑誘導大鼠關節炎A－A模型的建立方法:右后足墊部皮內注入FCA 0.1 ml于每只大鼠，建成A－A大鼠模型。

2.2 實驗分組

參照正交設計的方法，分析影響療效的因素，采用病程、局部取穴和整體取穴為三因素，局部與整體有交互作用，把毫針、火針、艾灸列為三水平。選取L9(34)正交設計表，將120只實驗動物模型隨機分成10組，每組12只，設立1組為模型對照觀察組，其余9組隨機分入9組實驗中，進行療效觀察。

2.3 治療方法

取穴方法:以華興邦等［1～2］研制的“大鼠穴位圖譜”為依據，參考比較解剖和骨度分寸法，模擬定位。整體取穴為:腎俞、大椎;局部取穴為:趾間、足三里。火針每3天1次，速刺，不留針。毫針、艾灸每2天1次，毫針留針30 min，艾灸時剪去穴位上鼠毛施灸，每穴3壯。各組均常規局部消毒后進行治療，一療程為30天。

2.4 觀察指標及制備方法

2.4.1 病理切片制備

快速頸椎脫位處死大鼠，立即除皮，切取足踝掌部，立即放入8%多聚甲醛溶液中固定，經EDTA脫鈣，常規梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，片厚約3～5 μm，分別用于HE染色觀察和免疫組織化學染色。HE染色下觀察炎細胞浸潤，滑膜增生，血管翳形成，軟骨破壞。采用免疫組織化學的方法觀察關節滑膜組織ICAM－1蛋白的表達。

2.4.2 病理情況定量分析

HE染色按照病變的嚴重程度給予“+”、“++”、“+++”不同級別的定量。求病理系數=(炎癥分值+滑膜分值+血管翳分值+軟骨分值)/理論最大值。①炎癥由輕到重分為4級:+輕度，記1分;++中度，記2分;+++重度，記3分;++++重度伴有壞死，記4分。②滑膜增生分3級:+輕度，記1分;++中度，記2分;+++重度，記3分。③血管翳形成:+記5分。④軟骨破壞:+記10分。

2.4.3 ICAM － 表達分析

按照陰性(－):免疫反應陽性，產物無黃色記1分;輕度陽性(+):免疫反應陽性，產物呈淡棕黃色記2分;中度陽性(++):免疫反應陽性，產物呈棕黃色記3分;強陽性(+++):免疫反應陽性，產物呈深棕黃色記4分。

3 統計分析

正交分析按照直觀分析及方差分析，各組間比較用F檢驗，前后自身比較用t檢驗。

4 實驗結果

各組造模前后右足腫脹比較有明顯差異，造模成功，各組間比較經統計學分析無差異，說明各組間有可比性［3］。

4.1 A－A大鼠足部病理切片的觀察比較

各干預組大鼠病理鏡下所見:第1組，滑膜重度增生，呈乳頭樣突出，炎性細胞浸潤，血管翳形成，血管(炎)增生，炎性細胞浸潤;第2組，滑膜上皮中度增生，組織粘連，血管增生，炎細胞浸潤，血管翳形成;第3組，滑膜重度增生并水腫，可見有淋巴細胞，漿細胞大量浸潤，組織壞死;第4組，滑膜上皮輕度增生，有炎細胞浸潤;第5組，滑膜上皮輕度增生，炎細胞浸潤;第6組，滑膜上皮中度增生，血管增生，炎細胞浸潤;第7組，滑膜上皮重度增生，炎細胞浸潤，血管上皮增生，纖維變性，血管翳形成;第8組，滑膜上皮輕度增生血管增生，炎細胞浸潤;第9組，滑膜增生不明顯，炎細胞浸潤，血管增生。見圖1～8。

統計分析:各病理嚴重程度按照前述的評分標準進行評分，取平均值相加，除以理論最大值即為各組的病理程度系數，系數越小，說明病變程度越輕，干預效果越好。列正交設計表及各組干預結果如表1。

圖1 第1組血管翳形成×100

圖2 第2組血管增生×100

圖3 第3組組織壞死×400

圖4 第4組滑膜上皮輕度增生×100

圖5 第6組血管增生，炎細胞浸潤×100

圖6 第7組血管上皮增生，纖維變性×100

圖7 第8組滑膜上皮輕度增生，血管增生×100

圖8 第9組滑膜增生不明顯，炎細胞浸潤，血管增生×100

表1 各組病理評分系數正交分析表

由表1可見，對A－A大鼠病理干預因素的排列由大到小為A＞B＞C＞D，優化條件為A2B2C2D3。進一步做方差分析由于D值最小，將其作為誤差進行比較，見表2。

表2 病理評分系數正交方差分析

根據極差分析的結果，優選方案為A2B2D3。

經F檢驗，只有A變異的P＜0.05，其余各變異無顯著性差異，說明A因素是為干預的主要因素，取其較好值為A2;C、D因素差值極小，說明對病理的干預影響不大，幾無影響，而C因素為A×B的影響，說明在本實驗中二者交互作用不大，故B可以任選，B2、B3皆可選用;D因素的影響最小，比空列C的極差還小，說明在本次實驗中所劃分的病程沒有對病理變化起到多大的影響，也許和病程之間的間距太短有關，這更加說明了RA是一個慢性而長期的病理過程。另外，A因素作為局部因素，結合消腫率的結果，說明局部治療對A－A具有直接而重要的意義。故其優選方案為A2B(2，3可看情況任選)。

4.2 局部病理組織中ICAM－1的表達觀察比較

ICAM－1顯微鏡下所見:病理切片按免疫組織化學染色后顯微鏡下觀察，正常對照組雙側滑膜上皮及滑膜纖維膜呈陰性或微陽性表達。A－A大鼠左后足滑膜上皮及滑膜纖維膜均呈陽性表達，右足滑膜上皮及纖維膜也均成陽性表達，而以纖維膜的表達明顯。其余治療組均取右足。第1組見滑膜上皮及滑膜纖維膜陽性表達;第2組見滑膜上皮及滑膜纖維膜的表達，血管內皮也有表達;第3組，滑膜纖維膜表達陽性;第4組滑膜上皮及纖維膜成陰性表達;第5組滑膜上皮及纖維膜成陽性表達;第6組滑膜上皮及血管內皮陽性表達;第7組滑膜上皮及纖維膜呈陽性表達;第8組滑膜上皮有輕微表達;第9組滑膜上皮可見有弱陽性表達。見圖9～13。

ICAM－1表達的分析比較，程度按照前述的評分標準進行評分，取小值為表達輕微。列正交表及各干預組評分結果如表3。

圖9 模型組ICAM－1表達強陽性(右)×100深棕黃色

圖10 正常對照ICAM－1表達陰性×100

圖11 第3組ICAM－1表達強陽性×100呈深棕黃色

圖12 第4組ICAM－1表達陰性×100

圖13 第4組ICAM－1表達輕微×100

表3 ICAM－1表達評分正交分析表

表4 ICAM－1表達評分正交方差分析

從表3、4可以看到，經方差分析，各組均未取得顯著意義，即各因素尚不能確定哪個為影響ICAM－1的主要因素;通過級差分析，可以直觀看到影響ICAM－1的因素由大到小排列為A＞C＞B＞D，A因素級差最大，是為主要因素，取較好值為A3，其余各因素相差不大，可以任意取。按照極差分析的結果，可取A3C2B2D3。

5 討論

類風濕關節炎(RA)是以慢性滑膜炎為特征，最終導致軟骨吸收、骨破壞和骨纖維化的自身免疫性疾病。RA滑膜的特征性改變為:滑膜A型細胞增殖、T淋巴細胞、B淋巴細胞及巨噬細胞浸潤、多形核細胞聚集以及滑膜成纖維細胞增殖和纖維沉積。其中T細胞激活是炎癥的核心。隨后引起一系列的炎癥免疫反應，導致滑膜增生、血管翳形成、軟骨侵蝕、變性壞死，這一過程是個慢性發展過程，很難完全阻斷，但臨床又有自行緩解的。在本次實驗中，干預組仍存在不同程度的滑膜炎癥，甚至有血管翳的形成，但可以看到干預組在病變程度上要比模型組輕微，且沒有軟骨病變形成，在一定程度上說明了針灸干預對于A－A大鼠的病變進程具有延緩作用。而以A2為最主要因素，說明局部的火針治療對于改善局部病理狀態具有重要價值。

上述炎癥過程中粘附分子(Adhesion molecules，ADMS)起著重要的作用。首先，粘附分子可介導循環中的白細胞粘附于滑膜高內皮小靜脈，并向血管外游出，聚集于滑膜，循環中的白細胞從血管移行到周圍組織是關節急性炎癥的一個標志，而慢性細胞免疫反應即淋巴細胞在關節滑膜的浸潤則是RA的免疫學特征。在上述過程中，粘附分子充當重要角色。它是介導細胞間和細胞與胞外基質間相互結合的細胞表面受體，參與介導細胞遷移、淋巴細胞活化、吞噬及靶細胞殺傷等多種作用;其次，可促進細胞間的接觸，并在抗原呈遞和細胞激活過程中提供輔助刺激因子;第三，使白細胞粘附于細胞外基質成分并停滯在炎癥局部［4］。炎癥細胞一旦進入滑膜即產生一系列細胞因子，如TNF－a、IL－1β、IL－6等，造成滑膜炎性病變而破壞關節，上述細胞因子反過來又可通過上調內皮細胞表面粘附分子表達而招致更多的白細胞浸潤［5］在早期RA患者，滑膜粘附分子表達的上調提示病情活動。

可以說ADMS影響著RA的4個病理期，國外Aori S等［6］發現，可溶性細胞粘附分子(sICAM －1)在RA患者外周血中的水平與其關節破壞的輕重程度呈正相關。近年來，許多學者探索用抗粘附分子或其受體的單克隆抗體治療RA。動物實驗和臨床前期試驗證實，粘附分子的單抗可以成功地阻斷及減輕RA的嚴重程度［7］。Arthur認為其機理是抗ICAM－1的單抗可抑制炎癥滑膜內皮細胞上的ICAM－1，因此能阻止T細胞進入滑膜。

ICAM－1可廣泛表達于RA滑膜組織巨噬細胞樣細胞、滑膜襯里細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞，且較OA廣泛［8］，本次實驗發現針灸治療對A－A大鼠病理局部的ICAM－1的表達具有一定的影響，隨著病理程度的不同而ICAM－1的表達也發生改變，在模型組ICAM－1呈強陽性表達，治療組除第1組外均較陽性組為輕微，并且有陰性表達。從微觀的病理變化到直觀的腫脹變化證實了針灸對RA治療的有效性，針灸治療下調了滑膜組織ICAM－1的表達，減輕了炎癥反應，減緩了病理進程。

［1］華興邦.大鼠穴位圖譜的研制［J］.實驗動物與動物實驗，1991(1):1－3

［2］林文注，王佩.實驗針灸學［M］.上海:上海科技出版社，1994:288－290

［3］郭榮勝，李鑫元.A－A大鼠模型足腫脹針灸方案優選的實驗研究［J］.現代中西醫結合雜志，2009(20):2379 －2471

［4］Sfikakis PP，Tsokos GC.Lymphocyte adhesion molecules in autoimmune rheumatic disease:basic issues and clinical expectations［J］.Clin Exp Rheumato1，1995，13(6):763 －777

［5］Veale DJ，Maple C.Cell adhesion molecules in rheumatoid arthritis［J］.Drugs Aging，1996，9(2):87 －92

［6］Aori S，Lmai K，Yachi A，et al.Soluble.Intercellular Adhesion Molecule－1(ICAM－1)Antigen in Patients with Rheumatoid Arthritis［J］.Scand J Immunol，1993，38:485 －490

［7］Mc Murray R W.Adhesion molecules in autoimmune diseaes［J］.Semin Arthritis Rheum，1996，25(4):215 －237

［8］任建.骨關節炎滑膜細胞間粘附分子1和轉化生長因子1表達的研究［J］.中華風濕病學雜志，1999，6(2):104