灰樹花母種培養基的篩選及不同碳、氮源對菌絲生長的影響

孟翔鵬，馬 琳，呂斯琦，孫 靜

灰樹花（Grifola frondosa）又名栗（子）蘑、貝葉多孔菌、蓮花菌、千（手）佛菌、云蕈、舞茸等。在分類學上隸屬于真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，多孔菌科，樹花屬。是近年來開發的珍奇藥食兩用菌之一，灰樹花因其均衡豐富的營養價值，顯著的醫療保健作用，而被譽為“食用菌王”，是極具發展前景的高檔食用菌。中國、歐美、日本等許多國家對灰樹花藥理作用的研究表明，灰樹花具有抗艾滋病病毒、抗癌、提高機體免疫、降血糖、刺激骨細胞生長和修復等多種藥理活性[1-5]。筆者對不同母種培養基上灰樹花菌絲的生長情況以及不同碳、氮源對灰樹花菌絲生長的影響進行分析比較，優選出適宜菌種擴種繁殖的培養基和固體培養所需碳源、氮源等營養條件。

1 材料與儀器

1.1 菌種 灰樹花（Grifola frondosa）購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.2 試劑 葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸氨（NH4NO3）、氯化氨（NH4Cl）、硝酸鈉（NaNO3）、亞硝酸鈉（NaNO2）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、硫酸鎂（MgSO4）、瓊脂均為國產分析純；馬鈴薯、麥麩、玉米粉為食品級。

1.3 儀器 CLIN-250C型生化培養箱（天津市華北實驗儀器有限公司）；JB-CJ-2FXS潔凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）；YXQ-LS-SⅡ型高壓滅菌鍋（上海博訊實業有限公司）；YS2-H Nikon生物顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）；AB204N萬分之一電子天平（上海精密儀器有限公司）；DSC-W570型數碼照相機（索尼數字產品有限公司）。

2 方法

2.1 供試培養基

2.1.1 試管母種培養基 配方A（g/L）：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基；配方 B（g/L）：綜合 PDA 培養基[7]；配方 C（g/L）：玉米粉 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，水 1 000 mL；配方 D（g/L）：麥麩 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，水 1 000 mL；配方 E（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨6，酵母粉 2，瓊脂 20，水 1 000 mL；配方 F（g/L）：板栗木屑 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，水 1 000 mL；配方G（g/L）：馬鈴薯 200，板栗木屑 200，瓊脂 20，水1 000 mL；配方 H（g/L）：馬鈴薯 200，麥麩 100，瓊脂20，水 1 000 mL；配方 I（g/L）：葡萄糖 20，硝酸銨 4，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂0.5，瓊脂20，水1 000 mL。

2.1.2 母種平板培養基 基礎培養基（g/L）：磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5，瓊脂20，水1 000 mL；以上培養基pH值約為6.0。

2.2 平板培養基碳源實驗 在基礎培養基中添加濃度為2g/L的蛋白胨，再分別添加20g/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖、陽性對照（PDA）和空白對照（不加碳源），制成平板，無菌接種0.5 cm2大小的菌絲塊，25℃黑暗培養，觀測其生長狀態。

2.3 平板培養基氮源實驗 在基礎培養基中添加濃度為20g/L的蔗糖，再分別添加蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、NaNO2，空白（不加氮源）為對照，制成平板，其余操作同上。

2.4 驗證實驗 將優選出的碳源和氮源組合成新的培養基，加入基礎培養基中，按上述操作，觀測其生長狀態，以上各組分別做5次重復。

2.5 數據處理與統計分析 菌絲日生長速度（mm/d）=菌落平均半徑（mm）/生長天數（d），實驗結果進行統計分析，用最小顯著差數法（LSD）進行比較。

3 結果與分析

3.1 灰樹花菌絲在9種不同的母種試管培養基上的生長情況 菌絲在9種試管培養基中均能生長，但表現各有差異，結果見表1。

表1 菌絲在9種不同的母種試管培養基上的生長情況

衡量菌種質量優劣的兩個重要指標是菌絲長勢強弱和生長速度（滿管時間）。灰樹花菌絲長勢特征中，菌落形態完整、色澤潔白、密度濃密、氣生菌絲量中等、菌絲粗壯、分支較多、可見鎖狀聯合等特征為菌種優良特征，符合以上特征的培養基為灰樹花最佳篩選培養基[8]。由表1可見，培養基C滿管時間最短，但是菌絲色澤為淡紅棕色，表明老化嚴重，不利于其作為后續液體發酵或栽培的母種使用，棄去不選。培養基B滿管時間為18 d，除了C之外，為生長速度最快的。除了未觀察到鎖狀聯合之外，其他特征均符合優良菌種特征，因此，選擇B配方，即綜合PDA培養基為灰樹花母種最佳培養基。

3.2 不同碳源對平板培養基中菌絲生長的影響灰樹花菌絲在5種碳源平板培養基中均能生長，但表現各有差異，結果見表2。果糖作為碳源時，菌絲生長速度最快，與陽性對照（PDA）沒有差異，平均日生長速度為2.46 mm/d，其次依次為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖。果糖與葡萄糖相比，差異有極顯著意義，因此選擇果糖作為最佳碳源。

表2 不同碳源對灰樹花菌絲生長的影響

3.3 不同氮源對平板培養基中菌絲生長的影響由表3可以看出，灰樹花菌絲利用氮源的能力不盡相同，對有機氮源（牛肉膏、蛋白胨和酵母粉）的利用能力顯著高于無機氮源，最適氮源為牛肉膏，菌絲日均生長速度2.09 mm/d，其次為生長速度沒有顯著差異的蛋白胨和酵母粉；無機氮源中，利用銨態氮（NH4Cl和NH4NO3）的能力明顯高于硝態氮（NaNO2和NaNO3），相比較差異具有顯著性。

表3 不同氮源對灰樹花菌絲生長的影響

3.4 最優碳、氮源對平板培養基中菌絲生長的影響 灰樹花菌絲在由果糖和牛肉膏組成的最優培養基中無論菌絲生長速度還是長勢，均表現良好：菌絲日均生長速度為3.0 mm/d，菌落形態完整，菌絲潔白，密度為++++，菌落較厚。

4 討論

通過灰樹花母種培養基配方的研究，結果表明：不同配方的培養基對灰樹花菌絲生長速度以及長勢都有較大影響，在供試的9種不同母種培養基中，篩選出最適合灰樹花母種生長的培養基是B配方，即PDA綜合培養基，滿管時間短、生長速度快、長勢強且不易老化。通過灰樹花平板培養基碳、氮源篩選的研究，結果表明：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖都可以作為灰樹花菌絲生長的碳源，但對菌絲生長速度和長勢表現有所不同，以果糖為碳源時日均生長速度最快（2.46 mm/d），菌落完整、菌絲潔白、密度最厚，為最佳碳源。蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、NaNO2作為氮源時，對灰樹花菌絲生長速度和長勢表現有所差異，以有機氮源最好，其中牛肉膏為氮源時日均生長速度最快（2.09 mm/d），菌落完整、菌絲潔白、密度較厚為最佳氮源，無機氮源利用較差，其中以銨態氮為氮源明顯好于硝態氮。在以篩選出的最佳碳源（果糖）和最佳氮源（牛肉膏）組合成的新的培養基進行驗證實驗時，結果表明：菌絲長勢良好，日均生長速度為3.0 mm/d，快于實驗結果3.2中以果糖為碳源時的速度（2.46 mm/d），也快于實驗結果3.3中以牛肉膏為氮源時的速度（2.09 mm/d）。

從差異顯著性上來說，有碳源組明顯優于無碳源組；果糖組明顯優于其他碳源組，原因可能是果糖在分子結構上是一種酮糖，而葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖都含有葡萄糖分子，即都含有醛糖結構，灰樹花體內代謝的酮糖酶多于醛糖酶，導致利用含有酮糖結構的碳源速度較快。另外一個原因可能是由于在步驟2.2碳源實驗中20g/L的果糖與2g/L的蛋白胨的碳/氮（C/N）相比其他4種糖的C/N更接近灰樹花最適C/N。

[1]Hiroaki Nanba,Noriko Kodama,Douglas Schar.Effect of Maitake(Grifolafrondosa)glucanin HIV-infected patients[J].Mycoscience,2000,41(2):293-295.

[2]Yuki Masuda,Noriko Kodama,Hiroaki Nanba.Macrophage J774.1cellisactivatedbyMZ-Fraction(Klasma-MZ)polysaccharide in Grifola frondosa[J].Mycoscience,2006,47(3):360-366.

[3]李海花.灰樹花多糖的免疫作用實驗研究[J].中華中醫藥學刊，2007，25（2）：365－366.

[4]周 偉，奚清麗，石根勇.灰樹花多糖對糖尿病小鼠的降血糖作用[J].江蘇預防醫學，2009，20（4）：17－20.

[5]Ashraf Saif,Ulrike Lindequist,Kristian Wende.Stimulating effects of Grifola frondosa on human osteoblastic cell cultures[J].J Nat Med,2007,61(1):231-238.