二苯乙烯苷及其β-環糊精包合物在大鼠體內藥代動力學研究*

歐陽慧子，任曉亮，王 強，王貴芳，趙 敏，戚愛棣

中藥何首烏（Polygoni multiflori Radix）源于蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥塊莖，其特有指標性成分二苯乙烯苷（THSG），即2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（2，3，5，4-tetrahydroxyl-diphenylethylene-2-O-glu coside）（見圖1），具有抗肺腫瘤，抗動脈粥樣硬化，降低膽固醇和血脂，提高免疫力等多種藥理活性[1-4]。但由于THSG具有水溶液中穩定性差、體內生物利用度低的特點，在一定程度上限制了其臨床上的應用[5]。β-環糊精（β-CD）作為經濟易得的藥用輔料，其安全性已被美國食品和藥物管理局（FDA）認證[6-7]。β-CD可以將藥物分子包入其空腔內，減小外部物理化學環境對其穩定性的影響，繼而對藥物起到保護性作用[8-9]。筆者利用β-CD對THSG進行包合，發現β-CD改性后的THSG體外穩定性有顯著提高，本研究對大鼠灌胃THSG及其β-CD包合物的藥代動力學行為進行研究，揭示β-CD包合作用對THSG體內過程的影響，為THSG制劑開發以及臨床前應用奠定基礎。

1 材料及方法

1.1 儀器 Waters 600E高效液相色譜系統（美國Waters公司）；AX205分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；N-EAVPTM111氮吹儀（美國Organomation公司）；高速離心機（美國Tomos公司）；超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑 THSG對照品（批號：110844－200606，中國藥品生物制品檢定所）；黃芩苷對照品（批號：110715－200212，中國藥品生物制品檢定所）；THSG提取物[自制，采用硅膠柱層析分離、重結晶純化制得，薄層色譜分析（TLC）顯示為單一斑點，二胺基聯苯胺（DAD）顯示為單一化合物峰，高效液相色譜（HPLC）法測定其純度≥96%]；β－CD（孟州市華興生物化工有限責任公司）；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；超純水（美國Millipore超純水制備系統）。

1.3 實驗動物 健康SD大鼠，級別SPF，雄性，體質量200～220g，購自中國醫學科學院放射醫學研究所，許可證號：SCXK（津）2005－000。

1.4 包合物的制備 1g THSG提取物加入300 mL β-CD溶液（9 mol/L），10℃下避光攪拌6 h，4℃靜置過夜后減壓回收溶劑得包合物粉末，用少量乙醇洗滌后真空干燥，得到包合物粉末。經熱重分析-差示量熱分析證實了THSG-β-CD包合物的形成，并用HPLC法測定該包合物中二苯乙烯苷含量為30.9%。

1.5 血漿樣品預處理 取大鼠血漿250 μL，精密加入50μL甲醇，50μL內標溶液（黃芩苷，1.4mg/L），渦旋10秒，加入0.2 mol/L的鹽酸溶液50 μL，渦旋1min，再加入甲醇750μL，渦旋3 min后14 000 r/min離心10 min。取上清液，氮氣吹干后，100 μL流動相復溶，14 000 r/min離心5 min，取上清液10 μL進樣分析。

1.6 色譜條件 色譜柱：Warers SymmetryShieldTM RP－C18（150 mm×3.9 mm，5 μm）；流動相：乙腈－水－磷酸[25∶75∶0.05；V∶V∶V]；流速：1.0 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：室溫。

1.7 藥代動力學研究 20只大鼠隨機分成2組，每組10只，給藥前禁食12 h，自由攝水。按75 mg/kg（以THSG含量計算）的劑量，分別灌胃THSG-β-CD包合物溶液和THSG水溶液。其中每組5只均于給藥后 2、10、30、60、120、240 min，另 5 只于 5、20、40、90、180、360 min 從大鼠眼底靜脈叢取血，置肝素化試管中，離心（3 500 r/min）10 min，分離血漿，儲存于-20℃待測。

2 結果與討論

2.1 特異性考察 分別取5只大鼠空白血漿各250 μL，除不加內標溶液外，其余按“1.6”項下血漿樣品預處理操作和分析，得空白血漿色譜圖（見圖2A），將一定濃度待測物的對照品溶液和內標溶液加入空白血漿中，依同法操作，獲得相應的色譜圖（見圖2B），THSG和內標的保留時間分別為3.95 min和8.25 min，依同法獲得灌胃給予THSG后的血漿色譜圖（見圖2C）。結果表明，血漿中內源性物質不干擾THSG和內標的測定。

2.2 標準曲線 取空白血漿各250 μL，加THSG對照品系列溶液50 μL，配制成相當于血漿濃度為0.025、0.050、0.10、0.20、0.80、1.60、3.20 mg/L 的 3 批血漿樣品，除不加50 μL甲醇外，按“1.5”項下樣品處理操作；以血漿中待測物濃度為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算,求得直線回歸方程為Y=7.703 4X-0.161，r=0.998 7。根據標準曲線，THSG的線性范圍為0.025～3.20 mg/L，定量下限為0.025 mg/L。

2.3 精密度與準確度 分別取大鼠空白血漿250 μL，按“2.2”項下方法配制成濃度為 0.05、0.20和0.80 mg/L的THSG低、中、高濃度質量控制（QC）樣品各6份，與標準曲線同時測定，連續測定3 d，即每個濃度有18個樣品。根據當日的標準曲線，計算QC樣品的測得結果，進行方差分析，計算本法的準確度與精密度，結果見表1。

表1 HPLC法測定大鼠血漿中THSG的精密度與準確度

2.4 提取回收率 分別取濃度為0.05、0.20和0.80 mg/L的THSG低、中、高濃度血漿樣品各6份，按上述方法處理操作后進樣分析；同時以相應對照品溶液50 μL和內標溶液50 μL加入處理過的大鼠空白血漿樣品渦流混合后進樣分析得峰面積，提取后的峰面積與之相比，比值計算提取回收率。大鼠血漿中3種濃度的THSG提取回收率分別為82.8%，83.5%和86.5%；內標提取回收率為62.3%。

2.5 穩定性 取大鼠空白血漿250 μL，按“2.2”項下的方法配制成濃度為0.20 mg/L的血漿樣品，考察其在避光室溫放置4 h內的穩定性、血漿樣品1次和3次冷凍—解凍循環以及處理后樣品室溫放置24 h內的穩定性。結果表明血漿樣品在不同條件下RSD均小于3.0%，表明大鼠血漿樣品在室溫避光，冷凍保存放置8 h內穩定。

2.6 藥代動力學研究 SD大鼠灌胃THSG及包合物后,THSG的平均血藥濃度經時曲線見圖3。血藥濃度數據用 DAS（Drug And Statistic 1.0）進行擬合，計算藥代動力學參數，結果見表2。β-CD對THSG的改性作用對其藥代動力學過程有明顯的影響，主要表現為：1）達峰時間提前，THSG經β-CD包合后在體內吸收速度加快。2）達峰濃度增高，大鼠灌胃THSG后的Cmax為 0.24 mg/L；THSG-β-CD組的Cmax為 1.16 mg/L。3）THSG-β-CD 組的藥物在體內停留趨勢比THSG組增加，MRT分別為89.01 min和72.76 min。4）β－CD包合物給藥后6 h THSG的AUC值是單獨給予THSG的近3倍，表明β-CD包合可顯著提高THSG口服生物利用度。

3 討論

THSG經β-CD改性后口服生物利用度明顯提高，吸收半衰期變短，消除半衰期延長，藥物從體內的表觀清除速率降低。推測可能由于THSG經β-CD包合后其生物穩定性增加，避免了藥物的分解和酶解。此外，β-CD可提高小腸細胞的膜通透性，增加藥物的吸收量，使藥物達峰時間提前且生物利用度提高。在胃腸環境中包合物與游離態THSG處于動態平衡狀態，隨著游離THSG的吸收，包合物中的THSG不斷向環境中釋放，從而使得胃腸道環境中的THSG維持一個較高的濃度，增加了藥物在腸道中的吸收時間，提高了THSG的吸收效果。β-CD還可被結腸部位的腸道菌群所降解而釋放出藥物，使其攜帶藥物在到達結腸后才被釋放吸收，增加藥物的吸收部位。

圖3 大鼠灌胃給予THSG和THSG-β-CD包合物血藥濃度-時間曲線

表2 THSG及其β-CD包合物主要藥動學參數（±s，n=5）

表2 THSG及其β-CD包合物主要藥動學參數（±s，n=5）

注：與 THSG 比較，*P<0.05。

藥代動力學參數 THSG THSG-β-CD Tmax（min） 9.00± 2.24 5.00± 0.00 Cmax（mg/L） 0.24± 0.09 1.16± 0.80*AUC0-360min[mg/（L·min）]11.50±3.9732.24±7.77*MRT（min） 72.76± 7.99 89.01± 22.99 VRT（min） 2 963.10±241.84 8 698.29±2 454.49*

THSG體內降解產物分析：大鼠灌胃給予THSG后，血漿樣品的色譜圖中除THSG色譜峰外，還出現了2個新的色譜峰（tR分別為2.3 min和3.5 min，THSG為4.0 min）。此2個色譜峰的面積隨時間變化具有一定規律性，推測為THSG在大鼠體內代謝產物色譜峰。其中tR=3.5 min的代謝物最為明顯，含量較高，推測是THSG在體內最主要的代謝產物，通過后期膽汁排泄研究，證明其為THSG葡萄糖醛酸結合代謝產物。

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