丹黃消炎膏提取工藝的研究

劉雪平，胡 君

糖尿病足或肢端壞疽是糖尿病的嚴重并發癥之一，也是目前醫學領域的一大頑癥，在中醫學屬“消渴”、“脫疽”范疇。千百年來，中醫治療糖尿病足大都采用中藥內服、外洗等方法。藥物貼敷療法有著幾千年的歷史淵源，是源于“天然醫學”的中藥透皮吸收的綠色療法之一，具有適應癥廣、操作簡便、療效明顯、經濟安全的4大優點。

外用丹黃消炎膏是本院外科在中醫整體辨證分型內治的基礎上研制純中藥制劑，臨床外用于糖尿病足壞疽創面,療效較好，功能強調扶祛邪、祛腐生新，組方治則為扶正脫毒，活血解毒。臨床用于糖尿病足壞疽。其處方中含有金銀花、當歸、黃柏等藥材，綠原酸是本品有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、解熱、升高白細胞、保肝利膽、免疫調節、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基等作用。

筆者借鑒傳統的水煎煮提取方式，取影響水煎煮提取的主要因素即煎煮次數、加水量、煎煮時間3個因素，各取3個水平進行L9（34）正交實驗。以丹黃消炎膏提取干膏率及處方中的主要藥效物質綠原酸含量為綜合評價指標，篩選丹黃消炎膏的最佳提取工藝。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器 島津高效液相色譜儀LC—10ATVP（島津儀器（蘇州）有限公司N2000數據工作站），SPD—10A VP（浙江大學智能信息研究所）；色譜柱IrreguLar-H C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）；梅特勒—多利托電子天平AG—135（瑞士）（天津三維公司）。

1.2 藥品與試劑 綠原酸對照品：（中國藥品生物制品檢定所購置，批號：110753—200413）；藥材（天津飲片廠），乙腈（色譜純），磷酸（色譜純），純化水，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 正交實驗設計 根據傳統提取方法以及藥材所含成分的理化性質的需要，選定提取時間、加水量、提取次數作為考察因素,以樣品的干膏率及綠原酸含量綜合評分為考察指標，采用L9（34）正交表設計進行實驗方案，因素水平安排見表1。

表1 正交因素水平表

2.2 丹黃消炎膏提取液（簡稱提取液）的制備 稱取處方量的各藥材共9份，按L9（34）正交實驗表各列所示條件提取，濾過，合并濾液濃縮至100 mL，備用。

2.3 提取液干膏率測定方法 分別精密吸取提取液樣品各25 mL，置于恒質量蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，移至干燥器內冷卻30 min，精密稱定，依公式：

2.4 綠原酸的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱IrreguLar-H C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸（12∶88）；流速：1 mL/min；檢測波長為327 nm；柱溫：室溫。理論板數按綠原酸峰計算應不低于4 000。

2.4.2 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1mL含49.6μg的溶液，即得。

2.4.3 線性關系考察 精密稱取綠原酸對照品12.5 mg加甲醇使溶解并定容于25 mL容量瓶中，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液 1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL 分別置 25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得不同濃度的對照品溶液。吸取各濃度的溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，以峰面積-濃度繪制標準曲線，得回歸方程：Y=7.02×10-8X，r=0.999 8。

結果表明，綠原酸的進樣量在0.2～2 μg之間與峰面積有良好的線性關系。

2.4.4 供試品溶液的制備及測定 取提取液1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，0.45 μm濾膜濾過，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定，即得。結果見表2。

表2 正交實驗方案及測定結果

2.4.5 加樣回收率實驗 采用加樣回收法，已知綠原酸濃度（2.97g/L）的提取液6份，分別置于50 mL容量瓶中，加入精密稱定的適量綠原酸對照品，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，濾過，測定，結果平均回收率為101.06%，RSD為1.846%。

2.4.6 重復性實驗 取同一供試品溶液，在2.4.1色譜條件下進行測定，重復進樣6次，記錄峰面積值，結果相對標準偏差（RSD）為1.40%，表明本法重復性良好。

2.4.7 重現性實驗 取同一提取液6份，按2.4.4方法制得各供試品溶液，在2.4.1色譜條件下進行測定，6份樣品含量的重現性良好，RSD為3.0%。

2.4.8 穩定性實驗 取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h 測定峰面積。結果 RSD 為1.93%,表明本溶液24 h內穩定性符合要求。

2.4.9 驗證實驗 根據篩選得到的最佳工藝提取3批樣品，測定綠原酸含量。

3 結果

3.1 正交實驗結果 對正交實驗結果作方差分析，所得方差分析結果見表3。

表3 方差分析表

直觀分析結果表明，在所考察的影響因素中，重要性依次為A>B>C。A因素中A3>A2>A1；B因素中B3>B2>B1；C因素中C1>C3>C2。方差分析結果表明：A因素的影響具有統計學意義（P＜0.05）；B 因素、C 因素的影響無統計學意義（P＞0.05）。考慮生產成本因素，因此，確定最佳提取條件為A3B2C3，即加10倍量水，提取3次，每次2 h。

綜合評分=干膏率評分×0.4+綠原酸含量評分×0.6。

3.2 驗證實驗結果 根據篩選得到的最佳工藝A3B2C3提取3批樣品，測定干膏率和綠原酸含量，結果平均干膏率為38.783 3%，綠原酸平均含量為（3.877 7g/L），驗證實驗結果均高于正交實驗，說明所篩選的提取工藝條件穩定可行。

4 討論

4.1 檢測波長的測定 取綠原酸對照品溶液在190～600 nm進行光譜掃描，綠原酸在327 nm處有最大吸收峰，根據《中國藥典》[1]2005年版一部金銀花項下，最終確定327 nm為檢測波長。

4.2 流動相的選擇 作綠原酸測定時，最常用的是乙腈∶0.4%磷酸，通過試用不同比例的流動相測定，發現比例為乙腈—0.4%磷酸（12∶88）時可使色譜峰與相鄰峰達到基線分離，方法簡便，結果準確。

4.3 綠原酸含量測定有干擾 本實驗在進行綠原酸含量測定時候發現綠原酸有干擾，隨即提取了黃柏、金銀花雙陰性樣品及黃柏藥材樣品進行測定，結果發現雙陰性樣品亦略有干擾，經查閱文獻得知可能是皂角刺造成，然后制備了金銀花、黃柏、皂角刺三陰性樣品及皂角刺藥材樣品，分別進樣10 μL測定，結果三陰性樣品無干擾。見圖1-3。

有關皂角刺、關黃柏中綠原酸的含量測定有待進一步實驗研究，本文不再贅述。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:化學工業出版社，2005:152.