骨樂(lè)寧膠囊對(duì)大鼠骨折模型VEGF的影響*

任守平，張榮位，金鴻賓

300211 天津醫(yī)院創(chuàng)傷中心（金鴻賓）

如何促進(jìn)骨折愈合，防止骨折延遲愈合或骨不連的發(fā)生，是當(dāng)今骨科研究的重要課題之一。近年來(lái)隨著基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展，有關(guān)中藥促進(jìn)骨折愈合的研究工作取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步[1]，凸顯出中醫(yī)中藥辨證施治促進(jìn)骨折愈合優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與骨折模型制作 4月齡Wister大鼠64只（合格證號(hào)SCXK津2009-0001），雌雄各半，平均體質(zhì)量為（230.00±37.35）g。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后用烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉，無(wú)菌操作，于右脛骨結(jié)節(jié)下2 mm處由前向后以磨鉆磨除脛骨前2/3骨質(zhì)，僅保留髓腔后側(cè)皮質(zhì)骨，形成約3 mm×4 mm近橫斷骨缺損區(qū)造模，術(shù)后腹腔注射硫酸慶大霉素2天以預(yù)防感染。標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)飼養(yǎng)（由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供），自由攝食、飲水。

1.2 治療藥物 骨樂(lè)寧膠囊：當(dāng)歸、黃芪、熟地黃、白芍、川芎、柴胡、赤芍、桃仁、紅花等組成。由天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬北辰中醫(yī)院制劑科制作提供。每粒含生藥0.3g。

骨折挫傷膠囊：哈爾濱華雨制藥有限公司生產(chǎn)中成藥，批號(hào)ZZ-5434-黑衛(wèi)藥準(zhǔn)字（1989）第300127號(hào)。主要成份有：紅花、大黃、當(dāng)歸、乳香、沒藥、血竭、土鱉蟲、自然銅等。每粒含生藥0.29g。

1.3 分組治療與標(biāo)本采集 造模后的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：骨樂(lè)寧高劑量組、骨樂(lè)寧低劑量組、骨折挫傷膠囊組、空白對(duì)照組，每組16只。按人與大鼠體質(zhì)量換算系數(shù)5.1計(jì)算，骨樂(lè)寧高劑量組用量為0.55mg/（g·d），骨樂(lè)寧低劑量組為0.30 mg/（g·d），骨折挫傷膠囊劑量為0.46 mg/（g·d）。造模術(shù)后第1天起按上述用藥量的蒸餾水混懸液灌胃給藥，每日1次；空白對(duì)照組給予等容量生理鹽水灌胃。

全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于治療 7、14、21、28 d 時(shí)，分4批拉頸處死，截取模型骨段，剔除脛骨周圍軟組織，20%中性福爾馬林液固定24 h，再經(jīng)脫水、脫鈣、切片、染色后觀察。

1.4 檢測(cè)方法 采用卵白素—生物素復(fù)合技術(shù)進(jìn)行免疫組化染色顯示血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。嚴(yán)格按照試劑盒（上海西唐生物技術(shù)公司）說(shuō)明要求操作，石蠟切片脫蠟至水后，3%雙氧水（H2O2）消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，再行抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉。滴加一抗、二抗等多重孵育，最后用二甲氨偶氮苯（DAB）顯色劑顯色，復(fù)染，封片。每骨切片在400倍鏡下取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中的陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)，再取其平均數(shù)作為個(gè)體陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)數(shù)并以Image-Pro圖像處理系統(tǒng)計(jì)算其染色面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行判斷，P＜0.05，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s）。

2 結(jié)果

骨折模型在不同時(shí)點(diǎn)骨痂中VEGF的表達(dá)。染色結(jié)果顯示在骨小梁及成骨細(xì)胞中著色，細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒樣改變，而細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，深棕黃色者為強(qiáng)陽(yáng)性，淺黃色者為弱陽(yáng)性，無(wú)著色顆粒者為陰性。可以看出VEGF在傷后第7天時(shí)即已有表達(dá)，但僅在少數(shù)成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中；第14天時(shí)達(dá)到峰值，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，第28天時(shí)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯減少。這一過(guò)程在相應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞染色面積統(tǒng)計(jì)上表現(xiàn)得更為突出，且與相關(guān)研究具有一致性[2-3]。總體在4個(gè)檢測(cè)時(shí)點(diǎn)的骨痂切片中骨樂(lè)寧膠囊高劑量組VEGF表達(dá)較其他各組強(qiáng)，空白對(duì)照組表達(dá)最弱，見表1和表2。

表1 骨痂切片VEGF染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s） 個(gè)/視野

表1 骨痂切片VEGF染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s） 個(gè)/視野

注：與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01，與骨折挫傷組比較：#P<0.05。

組別 n 7 d 14 d 21 d 28 d骨樂(lè)寧高 15 32.90±3.4 59.20±5.5**50.00±3.1*# 27.50±0.3骨樂(lè)寧低 16 27.10±2.9 43.70±3.0 39.50±4.2 22.70±1.9骨折挫傷 16 29.20±4.2 48.80±1.7* 36.80±4.3 21.80±2.2空白對(duì)照 14 22.20±3.0 36.80±2.5 34.00±3.9 20.90±2.6

3 討論

人體氣血循行于周身，外而營(yíng)養(yǎng)皮肉筋骨，內(nèi)而灌溉五臟六腑。故當(dāng)肢體受跌撲打擊外傷之時(shí)，皮肉筋骨雖首當(dāng)其沖的同時(shí)必然傷及氣血，外而為腫為痛，內(nèi)而臟腑功能失調(diào)。正如《正體類要》序中所指出“肢體損傷于外則氣血傷于內(nèi)，營(yíng)衛(wèi)有所不貫，臟腑由之不和”。血瘀氣滯所致的傷處腫痛實(shí)乃外傷之標(biāo)，而氣血臟腑功能失和才是傷病之本。治療則需氣血標(biāo)本兼顧。有實(shí)驗(yàn)研究證明中藥在骨折愈合的不同階段有著不同的作用及機(jī)制，過(guò)多使用活血化瘀藥可破壞骨折愈合自身相對(duì)穩(wěn)定的血氧代償機(jī)制，不利于新生血管的形成從而影響骨折愈合。骨樂(lè)寧膠囊立方旨在通過(guò)益氣活血以達(dá)到瘀去新生促進(jìn)骨折愈合的目的。

表2 骨痂切片VEGF染色陽(yáng)性細(xì)胞面積（±s）

表2 骨痂切片VEGF染色陽(yáng)性細(xì)胞面積（±s）

注：與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01，與骨折挫傷組比較：#P<0.05，##P<0.01。

×10-10m2/視野組別 n 7 d 14 d 21 d 28 d骨樂(lè)寧高 15 131.5±23.4**205.6±30.2**##174.6±18.2*#91.7± 9.6骨樂(lè)寧低 16 110.8±11.7 145.9±21.4 135.9± 9.7 78.9±14.1骨折挫傷 16 118.5±17.3* 159.9±14.3* 129.7±12.5 74.6±12.1空白對(duì)照 14 86.3±14.8 125.1±23.4 116.5±14.4 70.3±11.8

[1]任守平，金鴻賓.中藥對(duì)骨折愈合相關(guān)細(xì)胞因子作用的研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥，2010，26（6）：527－529.

[2]初同偉，王正國(guó)，朱佩芳，等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在骨折愈合中的作用[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2002，16（2）：75.

[3]任守平，金鴻賓.骨樂(lè)寧膠囊早期促進(jìn)骨折愈合的臨床研究[J].天津中醫(yī)藥，2010，26（4）：323－324.