黑曲霉降解水解單寧培養條件的研究

天津市畜牧獸醫研究所 喬家運 李 平 陳龍賓 王文杰＊

單寧也稱單寧酸，是一種存在于植物中的水溶性聚酚類物質，分子質量為500～3000 Da。單寧的化學性質活潑，飼料中的單寧易與蛋白質結合，因此具有抗營養作用；單寧抑菌作用的存在，也會限制食草動物對營養物質的利用（Frazier等，2010；Getachew 等，2008；Li等，2006）。 采用生物降解的方法，開展了對植物單寧生物降解的研究，通過單寧降解菌的作用，將分子質量較大的單寧降解為小分子化合物，從而降低或消除單寧的抗營養作用。在前期的研究中，從霉變葡萄中篩選出了一株具有單寧降解能力的黑曲霉 （喬家運等，2011），本研究考察時間、溫度、初始pH等外界條件對菌株降解單寧的影響，以提高菌株對單寧的降解能力。

1 材料與方法

1.1 菌株 黑曲霉SL-5（由中國科學院微生物研究所鑒定），由本實驗室篩選。

1.2 培養基 察氏培養基，NaNO33.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.01 g/L，蔗糖 30 g/L，121 ℃滅菌 20 min。

發酵培養基，在無糖察氏液體培養基中加入0.5%的水解單寧（國藥集團化學試劑有限公司），用于單寧降解率的測定。

1.3 培養時間對降解率的影響 250 mL三角瓶中加入50 mL發酵培養基，按5%接種量接種菌懸液，初始pH 7.0、28℃、180 r/min條件下，分別搖床培養 1、2、3、4、5 d，測定單寧降解率，考察培養時間對降解率的影響。

1.4 培養溫度對降解率的影響 250 mL三角瓶中裝入50 mL發酵培養基，按5%接種量接種菌懸液，初始pH 7.0、180 r/min條件下，分別在20、25、28、30、32、35 ℃溫度下培養 3 d， 測定單寧降解率，考察培養溫度對降解率的影響。

1.5 初始pH值對降解率的影響 250 mL三角瓶中裝入50 mL發酵培養基，按5%接種量接種菌懸液，在28℃、180 r/min條件下，分別在初始pH 6、6.5、7、7.5、8 時培養 3 d， 測定單寧降解率，考察初始pH對降解率的影響。

1.6 搖瓶裝液量對降解率的影響 在初始pH 7.0、28℃、180 r/min條件下，250 mL三角瓶中分別裝入 12.5、25、50、75、100 mL 發酵培養基，按 5%接種量接種菌懸液，培養3 d，測定單寧降解率，考察搖瓶裝液量對降解率的影響。

1.7 單寧濃度對降解率的影響 250 mL三角瓶中裝入50 mL察氏培養基，分別加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%水解單寧，按5%接種量接種菌懸液，在初始pH 7.0、28℃、180 r/min條件下培養3 d，測定單寧降解率，考察單寧濃度對降解率的影響。

1.8 單寧測定方法 采用絡合法測定單寧含量（楊文云等，1999）。量取30 mL培養液 [液溫（20±1）℃ ]移入500 mL燒杯中，加水至約300 mL，置（35±2℃）水浴中預熱，精確量取1 mol/L乙酸鋅溶液20 mL置于500 mL容量瓶中，加入14 mL氨水，搖勻使白色沉淀溶解，緩慢移入上述溶液，邊移入邊振蕩，移畢繼續振搖1 min后置于原水浴保溫30 min（間歇振搖數次），待反應完畢，定容。取反應溶液于離心機上以3000 r/min離心5 min，再取上層清液于離心機上以3500 r/min離心10 min后，精確量取50 mL上層清液，加300 mL蒸餾水、25 mL氯化銨—氨水緩沖液 （pH=10）和1 mL鉻黑T指示劑，以0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉滴定至溶液由酒紅色變為暗藍色，并用空白校正。1 mL乙酸鋅（1 mol/L）消耗單寧0.1446 g（楊麗平和楊永紅，2004）。絡合法測定單寧的含量按下式計算：

單寧含量/%=（20 ×CZn-10 ×CEDTA×V） ×0.1446；

式中，CZn是指乙酸鋅標準溶液濃度，mol/L；CEDTA是指 EDTA·2Na標準溶液濃度，mol/L；V 是指校正后的EDTA·2Na標準溶液滴定消耗量，mL。

通過發酵前后單寧量的變化，計算降解率。

1.9 數據分析 采用SPSS 13.0軟件進行數據分析，數據以平均值±SEM表示。

2 結果與分析

2.1 培養時間對降解率的影響 由圖1可以看出，培養第1天和第2天時，降解率增加速度比較緩慢，在第2天至第3天時降解率迅速增加，并在第3天達到最大值。隨著培養時間的延長至第4天和第5天，降解率變化幅度較小。

2.2 培養溫度對降解率的影響 由圖2可知，黑曲霉在28～30℃時對單寧的降解率達到最高值，當溫度低于28℃，或者高于30℃降解率開始降低。

圖1 時間對單寧降解率的影響

圖2 溫度對單寧降解率的影響

2.3 初始pH值對降解率的影響 從圖3可以看出，當初始發酵液的pH值為6.5時，黑曲霉對單寧的降解率達到最高值。pH值偏高或偏低均不利于微生物的生長，從而降低單寧的降解率。

2.4 搖瓶裝液量對降解率的影響 從圖4可以看出，菌株在250 mL三角瓶中培養時，當裝液量為50～75 mL時，單寧的降解率最高。

圖3 初始pH值對單寧降解率的影響

圖4 搖瓶裝液量對單寧降解率的影響

2.5 單寧濃度對降解率的影響 由圖5可知，培養液中單寧濃度較低時，單寧的降解率最高，隨著單寧濃度的增加，降解率逐步降低。

圖5 單寧濃度對單寧降解率的影響

3 討論

在前期的研究當中，篩選出一株具有單寧的降解能力的黑曲霉菌株（喬家運，2011），因此，本研究通過優化發酵條件，以提高黑曲霉對單寧的降解能力。

在菌體早期生長階段，由于菌體生長速度也比較慢，因此降解率增加速度較慢，之后經歷快速生長期，在第3天已達到平臺階段，之后變化較小。可以認為，由于培養較長時間后培養基中養分逐步減少，同時菌體代謝產物的反饋抑制也可能產生了一定的作用，造成菌體生長趨于停止（阮祥穩和任平，2009）。

由于微生物對單寧的降解是其分泌單寧酶的作用，微生物生長過程中分泌酶均有最適宜的溫度和pH，微生物在不同溫度和pH下的生長速度以及單寧酶的產量不同，因而單寧的降解率不同。

裝液量與發酵液中溶氧量有關，供氧量是影響菌體生長的重要因素。過多的溶解氧會造成單寧的氧化，過少的溶解氧會影響菌體的生長繁殖，抑制菌體的生長代謝。

高濃度的單寧會對菌體的生長和單寧的生物降解產生抑制（Bhat等，1998），因此降低了菌體的生長和單寧酶的分泌，降低單寧降解率。

4 小結

研究表明，黑曲霉降解水解單寧的適宜條件為：28～30℃，培養液初始pH 7.0，250 mL三角瓶中裝入50～75 mL培養液，180 r/min連續培養3 d。隨著單寧濃度的提高，降解率逐步降低。

[1]喬家運，李平，陳龍賓，等.單寧降解菌的篩選及降解研究[J].飼料工業，2011，32（5）：28 ～ 29.

[2]阮祥穩，任平.黑曲霉降解石榴皮單寧培養條件的研究[J].西北林學院學報，2009，24（2）：101 ～ 104.

[3]楊麗平，楊永紅.石榴皮的研究進展[J].云南中醫中藥雜志，2004，25（3）：45～47.

[4]楊文云，李志國，吳昊，等.絡合法測定塔拉單寧含量的研究[J].西南林學院學報，1999，19（4）：249 ～ 252.

[5]Bhat T K，Singh B，Sharma O P.Microbial degradation of tannins-a current perspective[J].Biodegradation，1998，9：343 ～ 357.

[6]Frazier R A，Deaville E R，Green R J，et al.Interactions of tea tannins and condensed tannins with proteins[J].J Pharm Biomed Anal，2010，51：490 ～ 495.

[7]Getachew G，Pittroff W，Putnam D H，et al.The influence of addition of gallic acid，tannic acid，or quebracho tannins to alfalfa hay on in vitro rumen fermentation and microbial protein synthesis[J].Anim Feed Sci Technol，2008，140：444 ～ 461.

[8]Li M S，Yao K，He Q，et al.Biodegradation of gallotannins and ellagitannins[J].J Basic Microbiol，2006，46：68 ～ 84.