海藻酸鈉包埋脫氮菌株工藝研究

酒衛敬, 汪 蘋, 李奧搏, 李金穗, 其其格

細胞固定化技術,是利用物理或化學手段將游離的微生物(細胞)或酶,定位于限定的空間區域,并使其保持活性且能反復利用的一項技術[1].固定化技術起初用于滴濾反應系統內生產醋酸[2],后來,應用于食品、醫藥、發酵工業中,近30年開始應用于廢水處理領域[3].日本、荷蘭在硝化細菌固定化技術方面作了一些研究[4-5],國內也有些學者致力于這方面的研究[6-8].采用固定化技術能高效率地將微生物或酶限制在特定的材料區域內部,達到提高微生物或酶的濃度、減少微生物流失、容易固液分離的目的.用固定化微生物技術處理廢水,具備承受有毒物質沖擊能力并能降解難生化有機物,成為最近幾十年廢水生物處理中的研究熱點.

本實驗用海藻酸鈉包埋脫氮菌株,并對包埋工藝及脫氮性能進行了研究,為其在工業方面的應用奠定基礎.包埋菌株可用于氨基酸廢水、發酵廢水、制藥廢水等多種含氮廢水的有效脫氮.

根據微生物細胞與載體的作用力及作用形式、微生物細胞被固定的狀態以及載體的性質,將固定化細胞的制備方法分為以下三類:吸附法、包埋法和交聯法.其中,包埋法應用較多,尤其以凝膠包埋法在工業中的應用最為廣泛[9-10].

固定化載體通常分為有機載體和無機載體兩種,實際應用的主要是有機載體,其中,目前應用最多的是海藻酸鈉和聚乙烯醇.海藻酸鈉作為天然高分子多糖類,用于細胞固定化,盡管強度不高,但對微生物無毒害作用,固定方法簡單,成本適中,是很好的包埋劑選擇.筆者選用海藻酸鈉作為包埋劑,用包埋法固定化脫氮菌株,可應用于氨基酸廢水、發酵廢水、制藥廢水等多種含氮廢水的有效脫氮.

1 材料及方法

1.1 實驗材料

一株具有異養硝化好氧反硝化脫氮性能的戴爾福特菌(Delftia),編號為WXZ-2;海藻酸鈉,氯化鈣.

異養硝化培養基:(NH4)2SO4為0.47 g/L,檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O)為5.1 g/L;碳源用量依據正交試驗設計COD/N比調節,KNO3為0.1 g/L,維氏鹽溶液為50 mL/L;用蒸餾水溶解,并同時調節初始pH值.

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化小球的制備過程

固定化水球的制備流程見圖1.

圖1 固定化小球的制備流程Fig.1 Process of forming immobilized beads

1.2.2 測定方法

ρ(NH+4-N)采用納氏試劑分光光度法測定;ρ(NO2-N)采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定;ρ(NO3-N)采用紫外分光光度法測定;pH值采用德國WTW便攜式測定儀測定.

2 結果與討論

2.1 海藻酸鈉質量分數范圍的選擇

小球的成球情況與海藻酸鈉的質量分數有很大關系,見表1.由表1可以看出,SA質量分數為3% ～7%時可滴制出形狀較好的包埋小球.

表1 海藻酸鈉(SA)質量分數對成球狀況的影響Tab.1 Effects of different concentration of sodium alginateon shape of immobilized beads

2.2 優化包埋條件

2.2.1 正交試驗

在上述實驗的基礎上,設計了四因素三水平正交試驗,各因素和各水平的選擇是參考有關研究[11-13]擬定的.試驗因素有:加入包埋劑中的細菌量(簡稱包菌量)、包埋劑質量分數、交聯時間及小球直徑,以固定化菌株的脫氮性能(即:氨氮和總氮去除率)為指標.通過正交試驗,優選包埋條件.各因素因子的水平取值見表2.

按1.1配制異養硝化培養基,調節pH值至7.0,并分裝在250 mL的錐形瓶中,在121℃條件下高壓滅菌20 min,然后放到已滅菌的操作臺中冷卻至室溫.稱取濕重為10 g(相當于干重約1 g)的小球,放至培養基中.然后放在恒溫振蕩搖床內培養.

表2 正交試驗設計表Tab.2 Orthogoal experiments design table

培養條件為:溫度為30℃,轉速為90 r/min(相當于DO質量濃度3.76～4.84 mg/L),COD/N為25,氮源為硝酸鉀和硫酸銨,初始NO3--N和NH4+-N質量濃度分別約為10 mg/L和100 mg/L,碳源為檸檬酸三鈉.培養4天,每隔24 h取樣一次,取樣后先離心分離,然后取上清液對 NH4+-N、NO3--N 和NO2--N質量濃度進行測定,TN質量濃度為NH4+-N、NO3--N和NO2--N質量濃度之和,計算NH4+-N和TN去除率,取其最大值.實驗結果見表3.

表3中數據說明:

1)氨氮去除率與總氮去除率最高組為同一組,即實驗5,表觀優選條件為A2B2C3D1.

2)表3中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示水平,j表示因素,如ⅡD表示小球直徑為3 mm的所有包埋條件,此條件在表中是試驗2、試驗6、試驗7,ⅡD的值應為3個對應條件下的結果加權平均值.每個因素不同水平下的平均值相差最大的二個數的差值,即為極差Rj.極差的大小反映各因素對指標影響的大小.即極差越大,因素對指標影響越大.最優水平的確定是根據Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj的大小選定的,平均值越大表明該水平越有利于指標結果,各最優水平的綜合即為理論最優條件.

1)數據計算:以因素B(SA濃度)為例,在因素B的1水平下有3組實驗,分別為1,4,7號實驗,歸為第一組.同樣,因素B的2水平下的2,5,8號實驗,歸為第二組.因素B的3水平下的3,6,9號實驗,歸為第三組.分別計算各組實驗結果加權平均值,填入表下部相應列中的相應位置上.如:

表3 WXZ-2號包埋小球的正交試驗結果Tab.3 Orthogoal experimental results of beads immobilized with WXZ-2

三者中的最大值減去最小值即為極差,即:RB=ⅢB-ⅠB=75.6-68.5=7.1.由以上計算可知ⅠB＜ⅢB＜ⅡB,所以因素B的最佳水平應取2水平,即SA質量分數為5%.其它同理.

2)因素影響分析:極差的大小反映各因素對指標影響的大小.在實驗的3個因素中,因素D的極差最大,為12.1,其次是C、B,A最小,從而可排出因素影響的順序為:D＞C＞B＞A,即小球直徑＞交聯時間＞SA質量分數＞包菌量.

3)優選方案的得出:由以上計算與分析可見各因素理論最佳水平為因素A取2水平,因素B取2水平,因素C取3水平,因素D取1水平.因此實驗的最優方案為A2B2C3D1,即包菌量為4%,SA質量分數為5%,交聯時間為12 h,小球直徑為2 mm.

以TN去除率為指標分析,分析方法同上,得出以下結論:

1)四因素三水平的理論最佳條件為:A2B2C3D1,即包菌量為4%、SA質量分數為5%、交聯時間為12 h,小球直徑為2 mm.與以NH+4-N去除率為指標分析所得和表3中的表觀優選條件均一致.

2)因素影響分析結果為:C＞B＞D＞A,即交聯時間＞SA質量分數＞小球直徑＞包菌量.

無論以氨氮去除率為指標還是以總氮去除率為指標,影響最小的因素都是因素A,即包菌量.

小球直徑是影響包埋菌株脫氮性能的一個重要因素.當小球直徑減小,等重量小球的比表面積可能會增大,并有利于小球內外物質之間的交換,從而提高脫氮性能.但是包埋小球的直徑太小時,滴制過程中易堵塞,會給制備過程帶來很多麻煩.因此,小球直徑2 mm為本實驗的最小研究水平.SA質量分數會影響固定化小球的機械強度、質量傳遞等,進而影響到微生物的活性.另外,濃度過高時,包埋劑的粘性增加,給固定化操作帶來不便,2.1確定了本實驗中海藻酸鈉濃度的研究范圍.海藻酸鈉在交聯劑中交聯的時間長短會對固定化細胞的活性產生影響.由表3可以看出,隨著交聯時間的增長,包埋小球的脫氮性能增強.因此,通過補充單因素實驗,研究交聯時間對包埋菌株脫氮性能的影響.

2.2.2 單因素實驗

包菌量為4%,海藻酸鈉質量分數為5%,小球粒徑為2 mm條件下改變交聯時間進行包埋實驗.本實驗共選定4,8,12,16,20 h 5個水平進行實驗.實驗結果如圖2.

圖2 交聯時間對脫氮性能的影響Fig.2 Effects of crosslinking time on nitrogen removal

交聯時間越長,所得固定化凝膠小球的強度越高,但凝膠小球內部的結構更為緊密,不利于基質的傳遞,從而使細胞失活率增大,因此,交聯時間不宜太長.由圖2可以看出,實驗范圍內最佳交聯時間為12 h,氨氮去除率為92.8%,總氮去除率為94.3%.

根據正交試驗和單因素實驗,選定WXZ-2在實驗范圍內的最佳包埋條件是包菌量為4%,海藻酸鈉質量分數為5%,交聯時間為12 h,小球粒徑為2 mm.包埋小球的最高氨氮去除率能達到92.8%,總氮去除率能達到94.3%.

3 結 論

1)通過正交試驗和單因素實驗優選出海藻酸鈉包埋脫氮菌株WXZ-2在實驗范圍內的最佳包埋條件:包菌量為4%,海藻酸鈉質量分數為5%,交聯時間為12 h,小球粒徑為2 mm.包埋小球的最高氨氮去除率能達到92.8%,總氮去除率能達到94.3%.

2)包埋后的菌株的脫氮性能與游離菌的脫氮性能(氨氮去除率94.9%,總氮去除率為95.3%[14])相當.

3)海藻酸鈉包埋法制備過程簡單,適用于脫氮菌株WXZ-2的固定化.可以解決菌株的保存、運輸問題,為優勢菌株廣泛應用于實際工程奠定了基礎.

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