玉米麩皮中阿魏酰低聚糖的制備

潘海曉, 劉海順, 王 靜, 趙 冰, 蘇 穎

玉米是世界三大糧食作物之一,它含有較多的酚類化合物,如:阿魏酸、香草酸和香豆酸等.酚酸都有很強的抗氧化活性,對于延緩人體衰老有顯著的作用.玉米麩皮中主要含有阿魏酸,其含量為0.4%～3.6%[1-3].在植物中,阿魏酸主要通過酯鍵與細胞壁多糖和木質素交聯,自身酯化或醚化形成雙阿魏酸.與其他植物細胞壁不同的是,玉米麩皮表面存在大量的纖維素、半纖維素,這嚴重影響酶解效率,而且研究發現,玉米麩皮中的阿魏酰低聚糖的結構也相當復雜[4-9].

阿魏酰低聚糖(feruloylated oligosaccharides,FOs)是低聚糖中不同位置上的糖羥基與阿魏酸羧基酯化形成的一類化合物.阿魏酰低聚糖由于既具有阿魏?；志哂杏H水性的低聚糖基團,因而具有較好的水溶性和耐熱性.近年來,雖然人們對天然抗氧化劑的研究比較多,但由于許多天然抗氧化劑不溶于水、不耐熱,因此阿魏酰低聚糖的生物活性已經引起了人們的研究興趣.研究發現,阿魏酰低聚糖的抗氧化性高于阿魏酸與VC,而且它可以體外抑制Cu2+誘導人體脂蛋白的過氧化反應,保護正常小鼠紅細胞免受氧化應激的傷害,是一種潛在的抗氧化劑[10-15].

本研究用廉價的玉米麩皮作原料,制備具有生理功能的阿魏酰低聚糖,以期為玉米加工副產物玉米麩皮的綜合利用提供一條新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米麩皮,中儲糧北京分公司承德糧油質檢中心,粉碎后過40目篩待用;耐高溫α-淀粉酶,北京奧博興生物技術有限責任公司;糖化酶,北京奧博興生物技術有限責任公司;堿性蛋白酶,諾維信公司;木聚糖酶,武漢新華揚生物有限公司;纖維素酶,北京寧馨兒生物科技開發有限公司;其他化學試劑均為分析級.

1.2 儀器與設備

SHZ-82型水浴恒溫振蕩器,江蘇省金壇市榮華制造有限公司;HH SY11-Ni2B型電熱恒溫水浴鍋,北京市長風儀器公司;JJ-1型精密增力電動攪拌器,常州國華電器有限公司;Spectrumlab 53型紫外-可見分光光度計,上海棱光技術有限公司;SHB-ⅢA型循環水式多用真空泵,鄭州長城科工貿有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米麩皮不溶性膳食纖維制備

在文獻[15]和文獻[16]制備玉米膳食纖維方法的基礎上,進行了修改:玉米麩皮100 g用粉碎機粉碎后,過40目篩,用高壓蒸氣在121℃處理,后取出加入1 000 mL餾水,60℃下攪拌20 h,使其充分溶脹.加入耐高溫α-淀粉酶、堿性蛋白酶和糖化酶將玉米麩皮酶解,將混合物沉淀,棄去上清液,用熱水,冷水清洗沉淀,至上清液無明顯混濁,再用酒精和丙酮洗滌,最后放置在真空干燥箱內45℃晾干.

1.3.2 玉米不溶性膳食纖維中阿魏酸含量的測定

10 mg玉米不溶性膳食纖維加入0.5 mL 2 mol·L-1氫氧化鈉,在搖床里反應 2 h,轉速 150 r/min,后加入0.3 mL 3.5 mol·L-1的磷酸調 pH 值到2.0.用乙酸乙酯萃取5次,每次加入乙酸乙酯1.6 mL,離心5 min,轉速1 000 g,上清液被放置在真空干燥箱內45℃晾干,在325 nm下用紫外分光光度計測其吸光值.

1.3.3 阿魏酰低聚糖的酶解工藝

建立旅游文化分享小課堂，學生可自由選擇自己感興趣的旅游相關知識，如自己關注的旅游相關新聞、導游常用的活躍氣氛小技能等，主要目的是促進學生積極參與課程學習，鍛煉語言表達能力，營造良好的課程學習氛圍。

分別以纖維素酶、木聚糖酶濃度、反應時間、底物濃度為變量,先后進行單因素和正交試驗,探索得到利用玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖的最優條件.

1.3.3.1 單因素實驗

1)最適反應時間的確定.稱取3 g玉米不溶性膳食纖維到100 mL三角瓶中,加入0.12 g木聚糖酶和0.24 g纖維素酶,再加入30 mL MOPS緩沖液(50 mmol/L,pH值為5.0),反應混合物置于一臺恒溫水浴搖床內,60℃下分別反應12,24,36,48,60 h,振蕩器轉速設為150 r/min.

2)最適纖維素酶量的確定.稱取3 g玉米不溶性膳食纖維到100 mL三角瓶中,加入0.12 g木聚糖酶,再分別加入0.12,0.18,0.24,0.30,0.36 g纖維素酶,后加入30 mL MOPS緩沖液(50 mmol/L,pH值為5.0),反應混合物置于一臺恒溫水浴搖床內,60℃下反應36 h,振蕩器轉速設為150 r/min.

3)最適木聚糖酶量的確定.稱取3 g玉米不溶性膳食纖維到100 mL三角瓶中,加入0.24 g纖維素酶,再分別加入0.06,0.12,0.18,0.24,0.30 g木聚糖酶,后加入30 mL醋酸緩沖液,反應混合物置于一臺恒溫水浴搖床內,60℃下反應48 h,振蕩器轉速設為150 r/min.

4)最適底物濃度的確定.分別稱取1～5 g玉米不溶性膳食纖維到100 mL容量瓶中,加入0.3 g纖維素酶和0.3 g木聚糖酶,再加入30 mL pH值為5.0的醋酸緩沖液,反應混合物置于一臺恒溫水浴搖床內,60℃下反應36 h,振蕩器轉速設為150 r/min.

1.3.3.2 正交試驗

為了探索酶解玉米麩皮獲得阿魏酰低聚糖的最佳條件,參考單因素實驗結果,采用正交表L9(43)設計正交試驗,試驗的因素水平見表1.

表1 玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖正交試驗因素水平表Tab.1 Design of orthogonal test in preparation of feruloyl oligosaccharides from maize bran

將酶解后的物質從恒溫水浴搖床取出后,在高壓鍋內100℃滅酶活10 min,后進行抽濾,收集濾液,并將濾液過0.45μm超濾膜,將得到的液體采用雙波長法在286 nm和325 nm下測定其吸光值,計算得到阿魏酰低聚糖的濃度.

2 結果與討論

2.1 玉米麩皮膳食纖維制備阿魏酰低聚糖的單因素實驗結果

2.1.1 反應時間對阿魏酰低聚糖產量的影響

反應時間對阿魏酰低聚糖產量的影響如圖1.由圖1可以看出,隨著時間的增加,阿魏酰低聚糖的產量逐漸增加,反應36 h,產量達到了最大值,之后隨著時間的增加,阿魏酰低聚糖產量有所下降,反應50 h后趨于平緩.這是因為隨著時間的延長,阿魏酰低聚糖進一步酶解為小分子的糖類,而導致其產量下降,后來隨著時間進一步延長,酶解效率達到極限,阿魏酰低聚糖含量基本達到平衡.通過單因素實驗我們得到,制備阿魏酰低聚糖的最佳時間為反應36 h.

圖1 反應時間對阿魏酰低聚糖濃度的影響Fig.1 Effect of reaction time on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.1.2 木聚糖酶濃度對阿魏酰低聚糖產量的影響

木聚糖酶濃度對阿魏酰低聚糖產量的影響結果如圖2.由圖2可以看出,隨著木聚糖酶質量濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產量也在逐漸增加,當酶質量濃度達到6 g/L的時候,阿魏酰低聚糖的產量便不再隨著酶質量濃度的增加而增加.這是因為隨著木聚糖酶酶量的增加,更多的半纖維素降解,阿魏酰低聚糖產量增加,木聚糖酶酶量繼續增加,酶解反應達到平衡,阿魏酰低聚糖含量不再增加.通過單因素實驗,我們得到制備阿魏酰低聚糖的最佳木聚糖酶質量濃度為6 g/L.

圖2 木聚糖酶濃度對阿魏酰低聚糖質量濃度的影響Fig.2 Effect of xylanase concentration on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.1.3 纖維素酶濃度對阿魏酰低聚糖產量的影響

纖維素酶濃度對阿魏酰低聚糖產量的影響如圖3.由圖3可以看出,隨著纖維素酶濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產量在逐漸增加,當酶質量濃度達到8 g/L時,阿魏酰低聚糖產量達到最大值,后隨著纖維素酶濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產量幾乎不變.這是因為,剛開始隨著纖維素酶濃度的增加,大量的不溶性膳食纖維降解為可溶性膳食纖維,木聚糖酶能夠更好地作用于半纖維素,因此阿魏酰低聚糖的含量增加,后隨著纖維素酶濃度的增加,纖維素酶降解細胞壁能力達到極限,阿魏酰低聚糖含量基本不變.由單因素實驗得到制備阿魏酰低聚糖的最佳纖維素酶質量濃度為8 g/L.

圖3 纖維素酶濃度對阿魏酰低聚糖濃度的影響Fig.3 Effect of cellulose concentration on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.1.4 底物濃度對阿魏酰低聚糖產量的影響

底物濃度對阿魏酰低聚糖產量的影響如圖4,由圖4可以看出,在其他條件一定的情況下,隨著底物濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產量在逐漸增加,當底物質量濃度達到133 g/L的時候,阿魏酰低聚糖的產量達到最大值,后隨著底物濃度的增加,阿魏酰低聚糖的產量下降,這是因為料液比太高,混合液太過粘稠,酶不能夠很好地與底物接觸,從而導致阿魏酰低聚糖的產量下降.由單因素實驗得到制備阿魏酰低聚糖的最佳底物質量濃度為133 g/L.

圖4 底物濃度對阿魏酰低聚糖濃度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on concentration of feruloyl oligosaccharides

2.2 玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖的正交試驗結果

在單因素實驗的基礎上,采用正交表設計正交試驗,探索利用玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖的最佳條件,結果如表2.

表2 玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖正交試驗結果Tab.2 Result of orthogonal test in preparation of feruloyl oligosaccharides from maize bran

運用極差對數據進行分析得到結果:RB＞RA＞RC＞RD,極差R的值越大,說明該因素的效應越大,從正交試驗可以得到制備阿魏酰低聚糖的主次因素依次是:底物濃度＞反應時間＞木聚糖酶濃度＞纖維素酶濃度.最佳因素水平為A3B3C1D2,考慮到實際情況,反應時間太長,不利于工業化生產,因此反應時間選擇36 h,即制備玉米麩皮阿魏酰低聚糖的最佳反應條件:底物質量濃度為165 g/L,木聚糖酶質量濃度6 g/L,纖維素酶質量濃度8 g/L,反應時間36 h,pH值為5.0,溫度60℃,得到的阿魏酰低聚糖濃度為2.127 mmol/L.

3 結 論

1)將玉米麩皮進行高壓處理,20 h的攪拌處理可以使玉米麩皮充分溶脹,后經酶解得到玉米麩皮不溶性膳食纖維,克服了玉米麩皮表面細胞壁堅硬,酶解反應效率低的缺陷.

2)利用纖維素酶輔助木聚糖酶反應制備阿魏酰低聚糖,由于玉米麩皮表面存在大量的纖維素、半纖維素,這嚴重影響木聚糖酶酶解效率,采用纖維素酶水解其中的纖維素,使得木聚糖酶能夠更好地作用于玉米麩皮細胞壁多糖.

3)利用纖維素酶輔助木聚糖酶酶解玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖,克服了傳統的利用酸解,有機溶劑提取而造成的污染,也克服了傳統的單一酶解玉米麩皮制備阿魏酰低聚糖效率低的缺點.

[1] 羅艷玲.堿解玉米皮制備阿魏酸的研究[J].食品學報,2007,7(5):97--101.

[2] 趙陽陽,歐仕益,林奇齡,等.低聚糖阿魏酸酯含量的快速測定方法[J].食品科學,2010,31(18):329--332.

[3] 薛楓.雙酶法降解玉米麩皮制備阿魏酸和低聚搪的研究[D].廣州:暨南大學,2003.

[4] Allerdings E,Ralph J,Steinhart H,et al.Isolation and structural identiflcation of complex feruloylated heteroxylan side-chains from maize bran[J].Phytochemistry,2006,67:1276--1286.

[5] Bunzel M,Allerdings E,Ralph J,et al.Cross-linking of arabinoxylans via 8-8-coupled diferulates as demonstrated by isolation and identiflcation of diarabinosyl 8-8(cyclic)-dehydrodiferulate from maize bran[J].Journal of Cereal Science,2008,47:29--40.

[6] Allerdings E,Ralph J,Paul F,et al.Isolation and structural identiflcation of diarabinosyl 8-O-4-dehydrodiferulate from maize bran insoluble flbre[J].Phytochemistry,2005,66:113--124.

[7] Funk C,Ralph J,Steinhart H,et al.Isolation and structural characterisation of 8-O-4/8-O-4-and 8-8/8-O-4-coupled dehydrotriferulic acids from maize bran[J].Phytochemistry,2005,66:363--371.

[8] Bunzel M,Ralph J,Funk C,et al.Structural elucidation of new ferulic acid-containing phenolic dimers and trimers isolated from maize bran[J].Tetrahedron Letters,2005,46:5845--5850.

[9] Rouaua X,Cheynierb V,Surget A,et al.A dehydrotrimer of ferulic acid from maize bran[J].Phytochemistry,2003,63:899--903.

[10] 袁小平.酶解麥麩制備阿魏酰低聚糖及其生物活性的研究[D].無錫:江南大學,2006.

[11] Ou SY,Kwok K C.Ferulic acid:pharmaceutical functions prepara-tion and applications in foods[J].J Sci Food Agric,2004,84(11):1261--1270.

[12] 焦霞,陳靜,歐仕益.麥麩酶解產物對糖尿病大鼠氧化應激損傷的保護作用[J].食品與機械,2006,22(2):27--29.

[13] Masuda T,Mizuguchi S,Tanaka T,et al.Isolation and struc-ture determination of new antioxidative ferulic acid glucoside esters fromthe rhizome of Alpinia speciosa,a Zingiberaceae plant used in Okinawanfood culture[J].J Agric Food Chem,2000,48(5):1479--1484.

[14] 張璟,歐仕益,張寧.麥麩酶解產品清除自由基的體外實驗研究[J].營養學報,2005,27:25--29.

[15] Rose D J,Inglett GE.Production of freruloylated arabinoxylo-oligosaccharides from maize(Ze mays)bran by microwave-assisted,autohydrolysis[J].Food Chemistry,2010,119:1613--1618.

[16] 胡葉碧.改性玉米皮膳食纖維的酶法制備及其降血脂機理研究[D].無錫:江南大學,2008.