HPLC法測定蓮須中木犀草素的含量

李彥博，孫 靜

蓮須為睡蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥雄蕊。味甘、澀，性平，歸心、腎經，具有固腎澀精之功效。主要成分為木犀草素、槲皮素、異槲皮苷、山柰素等黃酮類化合物［1］。《中國藥典》［2］僅收載顯微鑒別，無含量測定標準。本文首次采用HPLC法建立蓮須中木犀草素的含量測定方法，為控制蓮須藥材的質量提供實驗依據。

1 儀器與試藥

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，Waters二極管陣列檢測器(PDA 2996)，Waters Empower色譜工作站，UV-2401PC紫外分光光度計(日本島津)，sartorius電子天平。木犀草素對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:111520-200504);甲醇為色譜純;水為純凈水;其余試劑均為分析純。蓮須樣品經山東中醫藥大學石俊英教授鑒定為睡蓮科植物蓮的干燥雄蕊。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex-C18(4.6mm ×250mm，5μm);流動相:甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45);檢測波長:350 nm;PDA色譜峰光譜采集范圍:300～400 nm;流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;進樣量:20μL;理論塔板數按木犀草素峰計算應不低于2500。

2.2 檢測波長的選擇 取木犀草素對照品適量，用甲醇溶解，照紫外-可見分光光度法，在200～400 nm之間掃描，木犀草素在350 nm處有最大吸收，且峰形良好，故確定檢測波長為350 nm。

2.3 供試品溶液色譜峰純度檢查 由于中藥材無法制備陰性對照溶液，故選用二極管陣列檢測器對供試品溶液色譜峰純度進行檢查。實驗結果顯示，供試品溶液與對照品溶液在木犀草素保留時間處的光譜圖完全一致，表明供試品溶液在木犀草素保留時間處無其他干擾雜質。

2.4 線性關系考察 精密稱取木犀草素對照品(五氧化二磷干燥器中減壓干燥48 h)10.2 mg，用甲醇溶解并定容至100mL，作為木犀草素對照品儲備液(濃度為0.102 mg/mL)。分別精密量取木犀草素對照品儲備液 1、2、4、8、10mL，用甲醇溶解并定容至10mL，作為5個濃度的木犀草素對照品溶液。分別精密吸取20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以木犀草素進樣量C為橫坐標、吸收峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程:A=3744608 C-34106(r=0.9997)。表明木犀草素在 0.204μg～ 2.040μg之間與吸收峰面積呈良好線性關系。

2.5 精密度實驗 取同一木犀草素對照品溶液(濃度為0.0408 mg/mL)，在上述色譜條件下，連續進樣5次，測定，吸收峰面積分別為3054041、3033706、3053315、3046547、3020652，平均為3041652，RSD=0.47%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性實驗 取同一供試品溶液，分別于制備0、1、2、4、6 h 后測定，吸收峰面積分別為1829629、1825177、1818354、1812158、1806-626，平均為1818389，RSD=0.51%。表明供試品溶液在制備后6 h內基本穩定。

2.7 重復性實驗 取同一樣品，平行制備5份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算含量，結果分別為 0.0419%、0.0422%、0.0415%、0.0421%、0.0417%，平均為0.0419%，RSD=0.68%。表明方法的重現性良好。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量(0.0423%)的樣品6份，分別精密加入一定量木犀草素對照品，按樣品測定方法處理，測定，計算加樣回收率，結果見表1。木犀草素的平均加樣回收率為99.44%，RSD=0.82%。表明測定方法準確、可靠。

表1 木犀草素含量測定加樣回收率實驗結果(n=6)

2.9 樣品測定 取樣品粉末2 g，精密稱定，精密加入甲醇50mL，稱定重量，回流提取2 h，放冷，用甲醇補足損失的重量，濾過，取續濾液，用0.45μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，結果見圖1、表2。

圖1 木犀草素含量測定高效液相色譜圖

表2 蓮須中木犀草素含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 實驗過程中，筆者從提取方法、提取溶媒、提取時間3個方面對供試品溶液的制備方法進行了優化篩選。實驗結果表明，回流提取的效率高于超聲提取，以甲醇為溶媒提取效果優于乙醇;分別以1 h、2 h、3 h為提取時間的研究結果顯示，2 h木犀草素溶出即達到平衡，2 h以后，延長提取時間，測得木犀草素含量不再增加，故確定供試品溶液的制備方法為甲醇回流提取2 h。

3.2 實驗結果表明，不同產地的蓮須樣品中木犀草素含量有一定差異。其中浙江杭州產的蓮須木犀草素含量最高，達0.0844%;河北保定產的蓮須木犀草素含量最低，為0.0404%。前者高出后者一倍多。

3.3 HPLC法測定蓮須中木犀草素的含量，操作簡便、準確，重現性好，加樣回收率高，可以用于蓮須的質量控制，填補《中國藥典》蓮須項下無含量測定的空白。

［1］南京中醫藥大學.中藥大辭典.下冊［M］.上海:上海科學技術出版社，2006:2501.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:257.