芹菜素殼聚糖微球的制備及體外釋藥研究

張志國，閻雪瑩，李麗霞，何 禮，丁文財，侯鐵強

微球(Microsphere)系以天然、合成或半合成高分子材料為基質，將藥物均勻分散或包埋在骨架中而制成的球形載體給藥系統，屬基質型骨架微粒。目前，以殼聚糖(Chitosan，CS)為基質材料制備緩控釋制劑的研究己經取得了較大進展。芹菜素(Apigenin，AP)又稱芹黃素，是一種天然存在的黃酮類化合物，有"植物雌激素"之稱，廣泛存在于多種水果蔬菜、豆類和茶葉中，以芹菜中的含量最高，芹菜中提取的芹菜素占提取出的黃酮總量的17%［1］。芹菜素具有抗癌、抗氧化、抗炎、降血壓等多種功效［2］。但由于芹菜素不溶于水，親水性和親脂性均很差，故難以被消化道粘膜吸收，口服吸收差，大大限制了其臨床應用。因此，本文以生物降解型殼聚糖為載體，制備芹菜素殼聚糖微球，擬在提高芹菜素生物利用度、改善口服吸收、延長藥物釋放時間，為芹菜素新劑型的研究和開發提供實驗基礎。

1 試驗儀器與材料

1.1 試劑與藥品 芹菜素對照品(含量≥99%)、芹菜素原料藥(含量≥98%)，購自西安小草植物科技有限公司;殼聚糖(脫乙酰度92%，青島海普生物技術有限公司);甲醇(色譜純，DIKMA公司);其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 LC-2010 AHT型高效液相色譜儀(日本島津公司);數顯恒溫磁力攪拌器(HJ-6A，金壇市榮華儀器制造有限公司);Sartorius BT25S電子天平(德國 Sartorius公司);超聲波細胞破碎機(Scientz-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司);FTIR-8400S傅立葉紅外光譜儀(日本島津有限公司);光學顯微鏡(日本奧林巴斯 C011);JEOL JSM 6700F場發射掃描電鏡(日本電子);Mastersizer 2000激光粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司);KQ5200DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 試驗方法與結果

2.1 分析方法的確立

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(250mm ×4.6mm，5μm);流動相:甲醇-水(60∶40);流速:1.0mL/min;檢測波長:340 nm;柱溫:35℃;進樣量:10μL。

2.1.2 標準曲線的建立 精密稱取芹菜素對照品適量，置于25mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，配成1 mg/mL儲備液，再分別吸取該溶液適量，用甲醇配成 1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、24.0、32.0、40.0、48.0μg/mL 的溶液，用 HPLC 法測定，記錄峰面積。以芹菜素濃度C(μg/mL)為橫坐標、峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程:A=55027 C+16169，r2=0.9996。結果表明，芹菜素對照品濃度在1.0～48.0μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取濃度為15.0μg/mL的芹菜素供試品溶液，按照“2.1.1”項色譜條件下進樣測定分析，1 d內，每隔1 h進樣1次，連續進樣6次，計算日內精密度;每日測定1次，連續測定6 d，計算日間精密度。結果表明，此方法的日內、日間精密度良好，符合含量測定的要求。

2.1.4 回收率試驗 稱取50 mg空白殼聚糖微球于10mL無水乙醇中，再量取濃度為42.0、21.0、5.25μg/mL的芹菜素無水乙醇溶液10mL，二者混合后，按“2.3”項下進行包封率測定，代入標準曲線中計算檢出濃度，進行數據處理。結果表明，此方法的回收率為97.37% ±1.33%，符合方法學要求。

2.2 AP-CS微球的制備 采用復乳-乳化化學交聯法［3-4］制備微球。精密稱取一定量的殼聚糖細粉溶于5%的醋酸溶液8mL中，靜置使其充分溶脹除去氣泡備用，為初乳的外相;以三氯甲烷作為初乳內相。稱取一定量的芹菜素溶解于2mL三氯甲烷中。將內相加入外相中，置于超聲波細胞破碎機中，超聲3min后取出，逐滴加入到含4%span-80的液體石蠟40mL中。電磁攪拌器600 r/min攪拌，攪拌60min后加入交聯固化劑甲醛，固化120min。固化完成后，靜置傾去上層油相，用石油醚洗滌2次后，再用2%亞硫酸氫鈉溶液洗滌除去殘余的甲醛，異丙醇適量，洗滌2次，抽濾，干燥，即得AP-CS微球。

2.3 微球載藥量及包封率的測定 采用研磨-超聲法［5］對AP-CS微球進行包封率和載藥量的測定。將AP-CS微球50 mg于研缽中研磨成粉末，加入10mL無水乙醇繼續研磨至溶液顯土黃色，置于錐形瓶中超聲30min，靜置一段時間后，精密吸取上清液1mL，用無水乙醇定容至10mL，用0.22μm微孔濾膜濾過，注入液相色譜儀。計算微球中藥物的包封率和載藥量［載藥量(%)=微球中的藥物量/微球重量×100%;包封率(%)=微球中的藥物量/投藥量×100%］。微球經過處理后，通過顯微鏡觀察，微球在外力作用下已經被研碎，藥物可溶于無水乙醇溶劑中。因此，研磨-超聲法測定微球中藥物包封率方法可行。

2.4 正交試驗設計 在AP-CS微球的制備過程中，本文選取了影響微球載藥量和包封率較顯著的4個因素作為考察對象，即藥物與殼聚糖的比例(A)、殼聚糖濃度(B)、乳化劑 span-80濃度(C)、固化劑甲醛用量(D)，每個因素選取3個水平，以載藥量、包封率為指標，通過L9(34)正交試驗設計優選最佳工藝條件，進行評價。見表1。

表1 實驗影響因素和水平(n=3)

按照L9(34)試驗設計，共進行了9組試驗，每組3個平行樣，并進行綜合加權分析。微球平均載藥量x、平均包封率y均是越高越好，這里規定微球載藥量x=8.5%為滿分(100分)，X表示微球載藥量得分，用公式X=x/8.5×100，把各試驗號的微球載藥量轉化為分數;規定微球包封率y為73%為滿分(100分)，Y表示微球包封率得分，用公式Y=y/73×100，把各試驗號的微球包封率轉化為分數。載藥量和包封率的權重系數均為0.5，按公式Z=0.5 X+0.5 Y，計算綜合得分。見表2。

2.5 工藝條件的選擇 實驗設計的A、B、C、D因素均影響微球的包封率和載藥量，分析結果表明，各因素對載藥量、包封率的影響程度:A＞B＞D＞C，即藥物與載體比例＞殼聚糖濃度＞固化劑甲醛用量＞乳化劑span-80用量，由于C為不顯著因素，但對微球粒徑影響較大，雖然隨著乳化劑濃度C濃度增大粒徑減小，但是加入過高電磁攪拌器攪拌困難，綜合考慮，乳化劑span-80濃度確定為C2。最終確定最優水平:A1B1C2D2。

按最佳工藝，即藥物與殼聚糖的比例為1∶5，殼聚糖濃度為15 mg/mL，乳化劑span-80的濃度為4.5%，固化劑甲醛用量為1.8mL。制備4批微球，平均包封率為 69.69%，平均載藥量為8.54%。

2.6 微球形態、粒度分布及紅外光譜考察 按最佳工藝制得的微球，在光學顯微鏡下觀察形態，AP-CS微球呈圓形，邊界清晰，表面略顯粗糙，不粘連或極少粘連，見圖1;在場發射掃描電子顯微鏡下觀察，AP-CS微球呈圓球形，粒徑較均勻，表面較光滑，較少粘連，見圖2;激光粒度分析儀測定粒徑分布的結果表明，微球的平均粒徑為84.33μm，粒徑分布呈正態分布，90%以上微球的粒徑為50.0～110.0μm。

表2 正交試驗結果及方差分析

表3 正交試驗方差分析

紅外光譜結果表明，AP、AP與空白微球的物理混合物在1223 cm－1處均出現C-O-C官能團伸縮振動吸收峰，在1650 cm－1處均出現了-C=O官能團伸縮振動吸收峰，但是在含藥微球中，這兩處峰都出現減弱及寬化，且在其他位置上，與物理混合物有顯著性差異，表明AP-CS制備成功。

圖1 AP-CS微球顯微鏡照片(×40倍)

圖2 AP-CS微球的掃描電子顯微鏡照片

2.7 微球體外藥物釋放 芹菜素殼聚糖微球體外釋藥采用直接釋藥法測定。筆者考察了pH 6.8和pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液對AP-CS微球釋藥的影響。分別稱取AP-CS微球約30 mg(含芹菜素約2 mg)，置于盛有100mL pH 6.8、pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液的燒杯中，于電磁攪拌器(37±1)℃中，以75 r/min轉動。定時取釋放液2mL，同時補加等量釋放介質。釋放液經0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液于檢測波長處測定，以累積釋藥率對時間做圖，釋放率計算公式如下:

式中Ct為各時間點測得釋放介質中的芹菜素濃度(μg/mL)，W為投入微球劑型中芹菜素的總重量(μg)，V0為釋放介質的總體積，V為每次取樣體積。計算微球的累積釋放百分率，見圖3。

圖3 芹菜素殼聚糖微球的體外累積釋藥曲線

結果表明，AP-CS微球在pH 6.8、pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中36 h的累計釋放量分別達70.25%與74.14%，說明本實驗制得的微球制劑具有一定的緩釋作用。

根據《中國藥典》2010版附錄中微囊、微球與脂質體制劑的指導原則，開始0.5 h內的釋放量要求低于40%。本試驗制得的微球在0.5 h內藥物釋放量低于10%，符合藥典要求。

2.8 微球釋藥曲線的擬合 按優化處方和工藝制備的芹菜素殼聚糖微球釋藥結果分別以零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi方程進行擬合，以擬合優度(r)對方程擬合度加以判斷，得到擬合方程，見表4。

表4 芹菜素殼聚糖微球不同釋藥模型擬合方程

由表4可見，芹菜素殼聚糖微球在不同pH值的釋放液中，釋放模型擬合接近程度依次為:Higuchi模型＞一級動力學模型＞零級動力學模型。

3 討論

3.1 預實驗中，筆者采用了實驗室常用的乳化-化學交聯法，僅獲得了包封率為30.5%的微球。本文采用的復乳-乳化化學交聯法是在乳化-化學交聯法的基礎上發展起來的，更適合于芹菜素類疏水性藥物。結果表明，微球形態良好，具有較高的包封率和載藥量，符合微球制劑的粉體學要求。方法重現性好，簡單、可行。

3.2 微球的藥物測定方法種類較多，包括酸回流法、雙氧水氧化法、超聲粉碎法及溶菌酶等。本實驗采用復乳-乳化化學交聯法制備微球，殼聚糖分子2位游離氨基與甲醛通過氨醛縮合反應形成鍵橋，使微球固化，殼聚糖降解性發生變化。制備的微球不能被溶菌酶降解，也不能用硫酸、高氯酸消解。由于芹菜素在無水乙醇中具有一定的溶解度，因此，參考相關文獻，通過物理方法(研磨-超聲法)，取得了較好的結果，且該方法簡單、可靠、省時。

3.3 殼聚糖是一種高分子載體材料，相同相對分子質量下，脫乙酰度越高，溶液黏度越低。本實驗選擇了脫乙酰度92%、相對分子質量10萬的殼聚糖，是為了在相同黏度下提高殼聚糖的濃度，增加氨醛縮合反應的氨基數，使得生成的微球骨架更致密。殼聚糖粘度大，制備的微球易粘連，本實驗采用加大外油相體積的方法，較好地解決了微球粘連問題。

3.4 體外釋放度實驗是常用的微球制劑體外釋藥速度評價方法，文獻中應用較多的方法有直接釋藥法和透析法。筆者對影響AP-CS微球體外釋放度的方法進行了考察，預實驗結果表明，采用透析法微球的24 h累積釋藥僅為10%。分析可能有兩個原因:①殼聚糖分子量大，堵塞透析袋，影響藥物的釋放;②制劑是固態粉末，易沉積于透析袋底部，直接影響制劑與釋放介質的接觸面積。而采用直接釋藥法，將制備的微球直接投入釋放介質中測定，釋放效果較好。

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