花卉植物組織培養技術研究

花卉培養技術研究課題組

(淄博師范高等專科學校 數理科學系，山東 淄博 255130)

吊蘭又稱垂盆草、桂蘭、鉤蘭、折鶴蘭，西歐又叫蜘蛛草或飛機草，原產于南非，百合科多年生常綠草本植物。根肉質，葉細長，似蘭花。葉簇生，似花朵，四季常綠，是著名的觀葉花卉，被人們譽之為“空中花卉”。據研究，吊蘭具有吸收有毒氣甲醛和甲苯等芳香族化合物的功能，能起到凈化空氣的作用。吊蘭的根和全草可入藥，具有清肺、涼血止血等功效。長期以來，吊蘭都是用扦插的方式進行繁殖。其繁殖速度較慢，難以滿足市場需求。采用組織培養的方法，建立起無性繁殖體系，對吊蘭進行大量繁殖，具有十分重要的意義。本試驗對吊蘭的快繁技術進行了研究，以期得到吊蘭離體快繁的有效方案。

一、材料與方法

(一)實驗材料

1．初代培養：選用一年生生長健壯無病害吊蘭帶芽莖段作外植體。材料來源是生物實驗室吊蘭(Chlorophytum comosum)。

2．繼代培養：初代培養后誘導出的胚性愈傷組織及叢芽。由于時間和實驗室條件限制，我們直接將初代培養的吊蘭叢芽轉移到新的生根培養基進行生根培養，本步驟在實驗中省略留待進一步研究。

3．生根培養：各個初代培養試驗中生長健壯的無根苗。

4．移栽試驗:生根培養和培養中長出根和莖的健壯幼苗。

5．其它供試材料:萘乙酸(NAA)為分析純級，中國醫藥(集團)上海化學試劑公司生產，有效成分≥99.0%；6-芐基腺嘌呤(6-BA)(分析純)，為中國醫藥(集團)上海化學試劑公司生產，有效成分98.0%；凝固劑用瓊脂粉(化學純)，為上海SCRC國藥集團化學試劑有限公司生產的瓊脂粉(凝膠強度≥400)。糖為天津市化學試劑一廠生產的蔗糖(化學純)。

(二)試驗方法

1．外植體的選取：帶芽莖段

選取健壯無病蟲害幼莖為外植體，然后從盆栽母株中分割出當年長出的新生分株，從莖尖開始，在超凈工作臺上切割為1cm長的莖段作為初代培養的外植體進行培養。

2．初代培養：吊蘭帶芽莖段培養試驗

從無病蟲害的盆栽母株中分割出當年長出的新生分株，用自來水沖洗干凈，除去根及下部老化組織，小心剝去外面老葉(注意不要弄傷腋芽)，然后在頂芽以上橫切，去除葉片。先在實驗室用洗衣粉液浸泡5min，后用不間斷自來水沖洗10min。在超凈工作臺上，再從基部開始切為1cm長作為外植體(帶有芽體的)。去掉沒有芽體的莖段后，用75%酒精浸30秒，無菌水沖洗一次。再用10%NaClO浸泡，滅菌時間分別10min，然后用無菌水沖洗5～8次，接種到培養基上。培養7d 后，統計污染率。一個月后統計分化率。

3．生根試驗

將生長健壯的無根苗單株切下，接到各生根培養基中。每個星期記錄生根和整個植株的生長發育情況。

4．小苗移栽試驗

將長出根的小苗放在陰棚中煉苗，一段時間后，洗凈組培苗上面的培養基，假植到沙床上，澆透水，蓋上薄膜，一星期后揭膜。7d后統計假植成活率，20d后移栽到花盆或大田。

(三) 培養基

1．基本培養基

基本培養基為MS，初代培養基和增殖培養基附加糖3%，瓊脂0.5%；生根培養基不加說明的都用1/2MS附加糖6%，瓊脂0.5%；配加不同濃度的激素；PH值為5.8～6.0。

2．各階段的培養基

(1)吊蘭莖段初代培養

MS+6-BA1.0～3.0(單位為mg/L，下同)十NAA0.1～0.5，共9種培養基，分別為:

MS+6-BA1.0+NAA0.1；

MS+6-BA1.0+NAA0.2；

MS+6-BA1.0+NAA0.5；

MS+6-BA2.0+NAA0.1；

MS+6-BA2.0+NAA0.2；

MS+6-BA2.0+NAA0.5；

MS+6-BA3.0+NAA0.1；

MS+6-BA3.0+NAA0.2；

MS+6-BA3.0+NAA0.5。

(2) 不定芽增殖培養

MS+6-BA0.5～3.0(單位為mg/L，下同)十NAA0.1～0.5，共12種培養基，分別為:

MS+6-BA0.5+NAA0.1；

MS+6-BA0.5+NAA0.2；

MS+6-BA0.5+NAA0.5；

MS+6-BA1.0+NAA0.1；

MS+6-BA1.0+NAA0.2；

MS+6-BA1.0+NAA0.5；

MS+6-BA2.0+NAA0.1；

MS+6-BA2.0+NAA0.2；

MS+6-BA2.0+NAA0.5；

MS+6-BA3.0+NAA0.1；

MS+6-BA3.0+NAA0.2；

MS+6-BA3.0+NAA0.5。

(3)生根試驗

①糖濃度對無菌苗生根的影響

設5個濃度梯度:1/2MS+糖3%+NAA0.8；1/2MS+糖5%+NAAO.8；1/2MS+糖6%+NAAO.8；1/2MS+糖9%+NAAO.8；1/2MS+糖10%+NAA0.8。

②大量元素濃度對無菌苗生根的影響

設四個濃度梯度:1/4MS+糖6%+NAAO.8；1/2MS+糖6%+NAAO.8；3/4MS+糖6%+NAAO.8；MS+糖6%+NAAO.8。

3．培養基的滅菌

所有培養基均在1.1kg/cm2，121℃飽和蒸汽壓下滅菌20min。

(四)培養條件

培養室溫度為22℃～28℃，每天光照12h，光照強度1600～2000Lx。

二、結果與分析

(一)無性培養系的建立

1．外植體滅菌效果

根據吊蘭莖段的老嫩情況和受環境污染情況，將選取的材料在10% NaClO中分別浸泡8、9、10、15min，再過7d后統計污染的情況，見表1。

表1 莖段滅菌效果

從表1中可以看出，莖段外植體的滅菌效果均隨著滅菌時間的延長，污染率有所下降。對比四種滅菌時間長度滅菌15min時，滅菌效果最好，污染率為15.4%；其次是滅菌10min時，污染率為17.6%；滅菌 8min時的污染率最高，其污染率為30.1%。需要說明的是，NaClO是一種較好的表面滅菌劑，它可以釋放出活性氯離子殺死細菌，并且易分解，無殘留，其堿性很強，處理時間過長會對植物組織有一定的破壞作用。在此實驗中我們選擇了用NaClO處理10min。

2．不同濃度6-BA 與NAA配比對吊蘭莖段分化的影響

接種7d左右，莖段綠色轉深。培養12～15d時，外植體的切口邊緣及附近出現一些淡黃色圓粒狀突起，這些突起繼續生長約15d后直接形成不定芽。

表2 初代培養——不同濃度6-BA與NAA配比對外植體葉芽的分化的影響

在吊蘭的初代培養中，帶芽外植體雖然能夠合成一定數量的細胞分裂素。但由于數量不足，外源的細胞分裂素6-BA對建立不定芽的分化是必須的。數據顯示：最佳生芽培養基是MS+6-BA2.0(單位:mg/L，下同)+NAA0.1配比的培養基上分化率及分化系數最高，分別為69.2%和3.1，芽長勢最好。同時，6-BA對誘導不定芽分化有明顯促進作用。

(二)生根培養

1．糖濃度對吊蘭生根培養的影響

無根芽轉移到生根培養基上，7d后開始生根，15d后全部生根，連續培養45d后統計生根率，如下表3。

表3 糖濃度對吊蘭生根的影響

從試驗結果看出：吊蘭的根的分化能力極強，在45d后，其無根苗的根的分化率全部達到100%。并且，隨著糖的濃度的增加，無根芽的平均生根數總體上顯示上升趨勢。這說明在一定范圍內，糖對根的分化起到了促進作用，并且隨著糖的濃度增大，植物根的數量就越多。

2．大量元素對吊蘭生根的影晌

大量元素對吊蘭生根的影響結果，如下表4數據顯示。

我們認為，大量元素過少(1/4MS+糖6%+NAAO.8)，會引起根的分化率變低；大量元素過高(MS+糖6%+NAAO.8)，對根的分化也會起到抑制作用。吊蘭的無根芽進行生根分化的最佳培養基是1/2MS+糖6%+NAAO.8。

表4 大量元素對吊蘭生根的影響

吊蘭無根苗的生根培養要誘導其生根，必須選擇合適的生根培養基。表3和表4的數據表明，在我們設計的培養基中，以1/2MS+糖10%+NAA0.8配比的培養基為最佳，無根芽的生根率最高。吊蘭生根與很多因素有關，其中糖濃度和大量元素濃度都可以影響其生根。

(三)移栽

移栽是組培苗生產中重要的步驟之一。組培苗長期在全營養、高濕度、適合的溫度和光照條件中生長，生長環境較優越；試管苗對自然環境的適應能力極差，直接從培養容器轉入田間，很難成活。我們必須在移栽到大田以前，先人為創造出一種與移栽后生長條件相似的環境進行一段時間的適應，這有利于提高移栽的成活率。在吊蘭組培苗的移栽中，主要分幾步完成:

1．沙床的準備：沙床用沙:土=7:3混合成，提前一個星期用1～2‰的高錳酸鉀溶液澆灌滅菌消毒，并用薄膜將其封住，進行滅菌。

2．煉苗：生根培養的瓶苗培養兩個半月左右，置于無強烈直射光的陰棚里進行煉苗，為移栽試管苗進一步適應外界環境創造條件。

3．假植：煉苗一個星期后，將苗從瓶內取出，洗干凈附著在上面的培養基(注意不要弄傷根部)，假植在沙床上。種完后，適當澆水，蓋上薄膜，注意此時光照不要太強烈，要植物有一個慢慢適應的過程。

三、小結與討論

(一)小結

1．外植體滅菌效果：外植體滅菌有很多種方法，我們實驗中主要采用的是NaClO滅菌的方法。大量的實驗表明，利用升汞0.1%(HgCl2)10min進行滅菌效果更好，考慮到升汞是含有劇毒的重金屬鹽殺菌劑，我們初步建立的組培實驗室沒有相應的危險化學藥品處理系統，所以在組培中盡量避免使用劇毒品進行滅菌。在使用NaClO對外植體進行滅菌處理時，隨著時間的延長，滅菌效果越好。由于NaClO是堿性物質，長時間處理會對外植體有毒害作用。綜合考慮后，我們在試驗中選擇10% NaClO處理10min，取得比較好的滅菌效果。植物組培滅菌方法的選擇，要考慮外植體污染率的問題，還要考慮環境污染和材料的后期培養問題，是一個需要綜合考慮的關鍵性問題。

2．無性培養系建立：用帶芽吊蘭莖段作為外植體接種到各種培養基中進行培養，試驗結果表明，在所試驗的培養基中，最佳生芽培養基是MS+6-BA2.0(單位:mg/L，)+NAA0.1配比的培養基上分化率及分化系數最高，分別為69.2%和3.1，芽長勢最好，葉色青綠。在試驗中，我們看到，植物激素6-BA主要是促進芽的分化的作用[1](P58-63)，NAA主要促進根的生長和分化，在生芽試驗中，NAA含量過高，會明顯抑制植物花芽的分化。

3．胚性愈傷組織和不定芽增殖及分化：在這一部分，我們設定了培養基，考慮到條件的限制，并且對后續實驗沒有影響，暫時沒有進行這一步驟，我們希望在后續研究中進行試驗。

4．生根培養：在生根培養中，糖有助于吊蘭的生根。[2](P72-76)大量元素過少(1/4MS+糖6%+NAAO.8)，會引起根的分率變低；大量元素過高(MS+糖6%+NAAO.8)，對根的分化也會起到抑制作用[3](P94-102)。吊蘭的無根芽進行生根分化的最佳培養基是1/2MS+糖6%+NAAO.8。

(二)討論

1．吊蘭組培外植體的選擇：吊蘭培養過程可選擇的外植體很多，可以選擇葉片、莖尖、莖段或花器官材料的部位[4]。選擇外植體，關鍵要看其取材的方便性、材料數量的多少、材料的部位生理狀態、發育階段及取材時間是否有利于在初代培養中愈傷組織或不定芽的誘導，外植體的選擇是初代培養成功與否的關鍵因素。呂復兵(2004.10)等對馬達加斯加吊蘭的組織培養和快速繁殖進行研究后認為，單個的腋芽和頂芽，在培養過程中易褐變和出現水浸狀而死亡，存活率低。即使能存活，芽萌發的誘導期也較長；而整個帶芽莖段的抗褐化和水浸狀危害的能力較強，排除污染因素，存活率達100%，且芽萌發的誘導期較短[5]。吊蘭品種很多，我們對于不同品種的吊蘭的研究還很少，還有待于進一步的研究和探討。

2．植物葉片的整體培養：我們在試驗中，曾經將初代培養的個別吊蘭的整片作為一個整體放入生根培養基，發現25d后也能分化出根系。但是，只有兩條根，根系發生率極低，每條根的長度很長、很細，經過連續兩個月的觀察，也沒有更多的根出現。對于這個現象，我們沒有足夠多的數據支持，一直感到很困惑。我們計劃在以后的研究中進一步探討這個問題。

[1] 曹孜義(等).實用植物組織培養技術教程[M].蘭州:甘肅科學技術出版社,2002.

[2] 顏昌敬.植物組織培養手冊[M].上海:上海科學技術出版社,1990.

[3] 桂耀林(等).植物組織培養[M].北京:科學出版社,1985.

[4] 趙蓬暉,張江濤,馬紅衛.植物組織培養中的幾個常見問題與對策[J].河南林業科技,2001,21(2).

[5] 申玉華.組織培養技術在花卉栽培方面的應用概況[J].赤峰學院學報(自然科學版),2005,(4).