莪術(shù)油對雞胚絨毛尿囊膜新生血管抑制作用研究

葉曉林，徐世軍

最新研究表明，莪術(shù)油及其提取物對多種實體腫瘤如肝癌等有較強的抑制作用。同時莪術(shù)油中分離到的β-欖香烯已經(jīng)作為國家二類新藥用于多種腫瘤的輔助治療，顯示出較好的療效[1]。利用雞胚絨毛尿囊膜( chick chorioal lantoic membrane ，CAM) 研究血管生成的整體模型方法，已廣泛應用于糖尿病、腫瘤等方面的研究及藥物篩選 ，通過觀察藥物對 C A M局部新生血管的作用可以間接衡量藥物對血管生成能力的影響[2]。本文以莪術(shù)揮發(fā)油為研究對象，以雞胚絨毛尿囊膜模型為評價載體，探討莪術(shù)油對其血管新生的抑制效果，為其進一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

莪術(shù)藥材（浙江永嘉）；沙利度胺片(FYT)，（25mg/片常州制藥廠有限公司，批號：09012012）。雙抗，生理鹽水、碘酒、酒精、吐溫80，均由西南民族大學微生物實驗室提供。無菌明膠止血海綿（桂林天和藥業(yè)生物科技有限公司，批號20040602）。甲醇（成都市科龍化工試劑廠，批號：20090306）；丙酮（成都市科龍化工試劑廠，批號：20080128）。新鮮羅曼雞雞胚，取自非免疫健康雞產(chǎn)受精卵，自行孵化至7～8日齡（購自四川原種雞場）。GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1 藥物制備

莪術(shù)油：水蒸餾法提取，0.5%的吐溫80助溶，用無菌N.S配置成母液（濃度：23.078 gmL－1）。取母液1毫升，稀釋7個梯度，取后5個梯度液。沙利度胺片：用無菌N.S配成1.75 mgmL－1濃度后，過濾除菌，加雙抗，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 雞胚制備

新鮮羅曼雞雞胚照胚，用鉛筆標識出氣室和雞胚位置。置于37℃，相對濕度60%～80%的孵箱中孵育至7～8日齡，每天用自制檢卵燈觀察兩次，觀察雞胚的發(fā)育存活情況，篩選出發(fā)育良好，活力正常的雞胚用于實驗。

2.3 最大無毒濃度的測定

莪術(shù)油取五個梯度液即（B1、B2、B3、B4、B5），沙利度胺片溶液（陽性對照），N.S（陰性對照）。將孵育7～8天的雞胚隨機分組，3個/組。用錐子在酒精燈火焰燒灼消毒后，在氣室頂端和氣室下沿無血管處各鉆一小孔，針頭從氣室下沿小孔處插入，深1.5 cm，注射0.2 mL受試藥物后以石蠟封閉小孔，置孵育箱中直立繼續(xù)孵育，每12小時觀察一次，孵化5天。觀察各組存活情況，得出最大無毒濃度B2（2.3078×10-2gmL－1）。

2.4 莪術(shù)油對雞胚尿囊膜血管新生的影響

以B2為研究樣品，倍比稀釋5個梯度（D1、D2、D3、D4、D5），對照藥物，分組同前進行CAM試驗。開窗：雞胚發(fā)育第8天, 燈下照蛋觀察確定雞胚位置，作好標記，暴露接種部位。植入：取藥液200μL，浸入預先制備消毒好的0.2 cm3左右的明膠海綿，無菌置于雞胚CAM，接種后封口，放回37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，每12小時觀察一次，孵化5天。觀察明膠海綿區(qū)域血管形成情況，拍照。滿足成像面積在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)的照片用photoshop軟件將各圖片讀入工作區(qū)，并將其轉(zhuǎn)換為灰度值圖像，最后轉(zhuǎn)化為B/W圖像。計算血管面積值和面積比值（“白面積/黑面積”的數(shù)值，即為無血管與血管區(qū)域面積比值）。

2.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 藥物對CAM血管新生的抑制作用

揭開封口膜后首先肉眼觀察明膠海綿區(qū)域血管形成情況，然后用數(shù)碼相機拍照，結(jié)果見圖1-1～圖1-3，定性評價藥物對CAM血管的抑制作用。

圖1-3可見，莪術(shù)油組接種部位蒼白的無血管區(qū)十分明顯。

3.2 雞胚尿囊膜血管面積值和面積比值測定

3.2.1 形態(tài)學觀察 空白組CAM膜與載體盤融合，部分大血管貫穿。低、中、高劑量組均出現(xiàn)大小血管相對分布較少的淺色斑點。低劑量組中，盤周有小血管的密集的現(xiàn)象，中劑量和高劑量組盤周僅有少數(shù)細小血管，以點樣處為中心呈包繞或放射狀分布，結(jié)果如圖2-1～圖2-12所示。

圖像處理過程示意圖:

3.2.2 結(jié)果見表2。

表2 各組雞胚血管面積值/面積比值比較 （xˉ±SD）

由表2可以看出，空白組血管面積值和面積比值較低，莪術(shù)油各劑量組該比值均較空白組顯著增高，有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.01），而且劑量越大，血管抑制越明顯。

4 討論

中醫(yī)理論認為“陽化氣，陰成形”，血管的生成依賴于氣血。氣血是構(gòu)成和維持人體生命活動的基本物質(zhì)，活血破氣，導致氣血難以聚合“成形”，從而抑制了新生血管。莪術(shù)屬于破血逐瘀藥，具有破血行氣、消積止痛的功效，藥性峻猛，易耗氣、動血，使氣血耗散，難以聚合，所以抑制了新生血管的生成。而莪術(shù)的抗新生血管作用機理的研究目前已有一些進展。20世紀70年代，F(xiàn)olkman[3]首先研究發(fā)現(xiàn)了新生血管的生成在腫瘤生長中的重要作用，開創(chuàng)了該領(lǐng)域研究的先河。他在研究中發(fā)現(xiàn)：腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移很大程度上依賴腫瘤血管形成。實體腫瘤長到直徑 2～3 mm時，如果沒有新生血管形成，腫瘤細胞即進入休眠狀態(tài)，一旦血管形成，長入腫瘤組織后，腫瘤組織的血供由彌散變?yōu)楣嘧?。馮剛[4]等通過建立動物腫瘤模型，運用莪術(shù)油予以實驗治療，結(jié)合免疫組化，檢測其抑瘤率和腫瘤內(nèi)血管密度以及瘤體VEGF和bFGF表達的改變，證明其對腫瘤血管形成有明顯抑制作用，降低VEGF、bFGF的表達可能是其抑制腫瘤血管形成的主要機制之一。本研究顯示，莪術(shù)油可劑量依賴性地抑制新生血管的作用，且效果明顯，為以后進一步研究莪術(shù)的藥理作用提供數(shù)據(jù)支持。

[1] 李曉華,孫毅毅.莪術(shù)油通過誘導細胞凋亡抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖[J].西部醫(yī)學,2011,23(5):811.

[2] 茅彩萍,顧振綸,曹莉,等.葛根素對AGEs誘導CAM新生血管生成影響的實驗研究[J].中國藥理學通報,2005,21(4):420.

[3] Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogen esis depen-dent? [J].Joumal of the National Cancer Institute,1990,82:4.

[4] 馮剛,黃濤,盧宏達,等.莪術(shù)油注射液對小鼠移植性S180肉瘤血管形成的抑制作用[J].腫瘤研究與臨床,2005,17(4):233.