高效液相色譜法測定白芍藥材中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量

李偉，張建軍，王衛茜，陳振振，王景霞，歐麗娜

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經，功能平肝止痛，養血調經，斂陰止汗。白芍中主要含有單萜及其苷類化合物，稱為白芍總苷（TGP），包含芍藥苷、芍藥內酯苷、氧化芍藥苷（又名羥基芍藥苷）、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷、芍藥苷元酮和白芍苷R1等十余種成分［1～4］。目前，對芍藥苷的活性研究較多，白芍藥材及含白芍制劑的質量控制多以芍藥苷為指標，采用高效液相色譜法測定，但對芍藥內酯苷的研究較少，近年來對芍藥內酯苷的活性和含量測定越來越引起重視［5～6］。為更好的控制白芍藥材質量，指導其藥學、藥效毒理學研究，本研究建立了采用高效液相色譜法同時測定白芍藥材中芍藥苷、芍藥內酯苷的方法。

1 儀器與試劑

Agilent1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Kromasil C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱(瑞典EKA Chemicals公司)，超聲波清洗器（功率250 W，頻率50 kHz）(濟寧天華超聲電子儀器有限公司)，甲醇(色譜純，Merck公司)，水為超純水，磷酸、氫氧化鈉為分析純。芍藥苷對照品購自：中國藥品生物制品檢定所(供含量測定用，批號：110736-200732)；芍藥內酯苷對照品購自：wako日本和光純藥公司(批號：016-22201)。本研究收集市售白芍藥材樣品8批，由北京中醫藥大學基礎醫學院方藥系臨床中藥教研室張建軍副研究員鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactif l ora Pall.的干燥根。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥內酯苷對照品和芍藥苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL各含0.02 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取白芍藥材粉末約0.1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入稀乙醇45 mL，超聲提取30分鐘，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸溶液（用1%氫氧化鈉溶液調節pH值至4.2）（34∶66）為流動相，檢測波長為230 nm。進樣量10 μL，理論板數按芍藥苷峰計算應不低于2000。見圖1。

2.4 檢測波長的確定

經紫外光譜掃描，確定檢測波長為芍藥內酯苷和芍藥苷的最大吸收波長230 nm。

2.5 線性關系考察

精密稱取芍藥內酯苷對照品適量，加甲醇配制成每1 mL含芍藥內酯苷0.0018 mg，0.0036 mg，0.0072 mg，0.0144 mg，0.0288 mg，0.0576 mg的溶液；精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇配制成每1 mL含芍藥苷0.0028 mg，0.0056 mg，0.0112 mg，0.0224 mg，0.0448 mg，0.0896 mg的溶液。分別吸取各對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定峰面積，繪制標準曲線。結果表明，芍藥內酯苷在0.018～0.576 μg范圍內呈線性關系，其回歸方程為：Y=926.19X-0.9368，r=0.9999；芍藥苷在0.028～0.896 μg范圍內呈線性關系，其回歸方程為：Y=1440X-0.3503，r=0.9999。

2.6 對照品純度考察

分別精密稱取芍藥內酯苷和芍藥苷對照品，用流動相溶解，制成每1 mL含量為2.58 mg和2.36 mg的對照品溶液，吸取20 μL注入高效液相色譜儀，按面積歸一化法測定純度。結果表明，芍藥內酯苷對照品純度為98.51%，RSD為0.22%；芍藥苷對照品純度為98.61%，RSD為0.18%。

2.7 儀器精密度實驗

精密稱取芍藥內酯苷和芍藥苷對照品，重復進樣6次，測定峰面積，計算RSD分別為1.2%，0.94%。

2.8 穩定性實驗

取芍藥內酯苷和芍藥苷對照品溶液及供試品依法制備成供試品溶液，在0、24、48小時內依法測定。結果表明，芍藥內酯苷和芍藥苷對照品溶液和供試品溶液在48小時內穩定，RSD分別為0.67%，0.95%；0.97%，0.61%。

2.9 樣品重復性實驗

精密稱取同一批次白芍藥材6份，按上述方法測定芍藥內酯苷和芍藥苷含量。測得芍藥內酯苷、芍藥苷的平均含量分別為0.75%、3.13%，RSD分別為1.27%，1.32%，表明方法重復性良好。

2.1 0 回收率實驗

精密稱取已知含量的同一批次白芍藥材0.05 g，按樣品重復性實驗結果計算芍藥內酯苷含量為7.48 gkg-1，分別精密加入芍藥內酯苷對照品0.358 mg，按供試品溶液制備方法及上述高效液相色譜條件操作，測定含量，計算回收率。結果表明，芍藥內酯苷平均回收率98.18%，RSD%為1.78%。結果見表1。

表1 芍藥內酯苷回收率實驗

精密稱取已知含量的同一批次白芍藥材0.05 g，按樣品重復性實驗結果計算芍藥苷含量為31.30 gkg-1，分別精密加入芍藥苷對照品1.502 mg，按供試品溶液制備方法及上述高效液相色譜條件操作，測定含量，計算回收率。結果表明，芍藥苷平均回收率為98.26%，RSD%為1.25%。結果見表2。

表2 芍藥苷回收率實驗

2.1 1 樣品含量測定結果

從白芍藥材的主要產地（浙江、安徽、四川）收集多批次未經硫磺熏制加工的白芍藥材樣品，按上述含量測定方法進行含量測定。結果表明芍藥內酯苷和芍藥苷含量分別不少于0.75%和2.71%，平均值分別為0.95%和2.93%。結果見表3。

表3 白芍藥材含量測定結果

3 討論

3.1 氧化芍藥苷干擾芍藥內酯苷含量測定

參考以往文獻報道，采用下述3種流動相進行高效液相色譜法檢測，方法①：采用中國藥典2010版一部白芍藥材芍藥苷含量測定項下流動相乙腈-0.1%磷酸溶液（14:86）；方法[7]②：采用甲醇-水（30:70）為流動相[8]；方法③：采用中國藥典2010版一部赤芍藥材芍藥苷含量測定項下的流動相甲醇-0.05molL-1磷酸二氫鉀溶液（40:65）[9]。結果見圖2。方法①和②的色譜圖均為兩個峰，但芍藥內酯苷加樣回收率不符合規定，說明可能該方法不能準確測定芍藥內酯苷；方法③色譜圖為三個峰，芍藥內酯苷芍藥苷之間有一個色譜峰且和芍藥內酯苷不能完全分離，調整流動相中有機相和水相的比例亦無法分離；同一樣品，在芍藥苷峰面積近似的情況下，方法③芍藥內酯苷和該未知成分的色譜峰面積之和與方法①和②芍藥內酯苷面積基本相等。結果表明在以上條件下，白芍藥材中含有對芍藥內酯苷檢測有干擾的成分。經與氧化芍藥苷對照品進行對照，確定此干擾成分為氧化芍藥苷。

3.2 采用甲醇與適宜pH的鹽溶液組成的流動相可以同時測定芍藥苷、芍藥內酯苷

對芍藥苷、芍藥內酯苷和氧化芍藥苷的化學結構進行比較，芍藥內酯苷和芍藥苷是同分異構體，但芍藥內酯苷具有內酯結構，極性比芍藥苷大；氧化芍藥苷比芍藥苷多一個酚羥基，極性也比芍藥苷大。而氧化芍藥苷色譜行為易受pH影響，可利用酸堿性使其與芍藥內酯苷分離。

流動相采用甲醇-不同pH的磷酸-磷酸鹽溶液，配制含有芍藥苷、芍藥內酯苷和氧化芍藥苷的對照品溶液，以3個色譜峰的分離度為指標，對流動相的pH進行考察。結果見圖3。結果表明，改變流動相pH，芍藥內酯苷和芍藥苷的分離度沒有明顯改變，而氧化芍藥苷隨流動相pH升高，保留時間縮短；反之，pH降低，保留時間延長。確定選用pH為4.2的流動相，可使3個色譜峰完全分離，并可節省檢測時間。

芍藥內酯苷和芍藥苷均為白芍中含量相對較高的單萜類成分，目前2010年版《中國藥典》只規定了白芍藥材和飲片中的芍藥苷的含量，未規定芍藥內酯苷的含量。本研究為確定白芍藥材中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量提供了方法，對于白芍藥材、飲片或制劑生產的質量控制具有指導意義。

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[9] 中華人民共和國藥典委員會《中華人民共和國藥典》一部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:147.