高效液相色譜法測定白芍藥材中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量

李偉，張建軍，王衛(wèi)茜，陳振振，王景霞，歐麗娜

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，功能平肝止痛，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗。白芍中主要含有單萜及其苷類化合物，稱為白芍總苷（TGP），包含芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷（又名羥基芍藥苷）、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷、芍藥苷元酮和白芍苷R1等十余種成分［1～4］。目前，對芍藥苷的活性研究較多，白芍藥材及含白芍制劑的質(zhì)量控制多以芍藥苷為指標(biāo)，采用高效液相色譜法測定，但對芍藥內(nèi)酯苷的研究較少，近年來對芍藥內(nèi)酯苷的活性和含量測定越來越引起重視［5～6］。為更好的控制白芍藥材質(zhì)量，指導(dǎo)其藥學(xué)、藥效毒理學(xué)研究，本研究建立了采用高效液相色譜法同時(shí)測定白芍藥材中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的方法。

1 儀器與試劑

Agilent1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Kromasil C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱(瑞典EKA Chemicals公司)，超聲波清洗器（功率250 W，頻率50 kHz）(濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司)，甲醇(色譜純，Merck公司)，水為超純水，磷酸、氫氧化鈉為分析純。芍藥苷對照品購自：中國藥品生物制品檢定所(供含量測定用，批號：110736-200732)；芍藥內(nèi)酯苷對照品購自：wako日本和光純藥公司(批號：016-22201)。本研究收集市售白芍藥材樣品8批，由北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方藥系臨床中藥教研室張建軍副研究員鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactif l ora Pall.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥內(nèi)酯苷對照品和芍藥苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL各含0.02 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取白芍藥材粉末約0.1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入稀乙醇45 mL，超聲提取30分鐘，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸溶液（用1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.2）（34∶66）為流動(dòng)相，檢測波長為230 nm。進(jìn)樣量10 μL，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。見圖1。

2.4 檢測波長的確定

經(jīng)紫外光譜掃描，確定檢測波長為芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的最大吸收波長230 nm。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取芍藥內(nèi)酯苷對照品適量，加甲醇配制成每1 mL含芍藥內(nèi)酯苷0.0018 mg，0.0036 mg，0.0072 mg，0.0144 mg，0.0288 mg，0.0576 mg的溶液；精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇配制成每1 mL含芍藥苷0.0028 mg，0.0056 mg，0.0112 mg，0.0224 mg，0.0448 mg，0.0896 mg的溶液。分別吸取各對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，芍藥內(nèi)酯苷在0.018～0.576 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其回歸方程為：Y=926.19X-0.9368，r=0.9999；芍藥苷在0.028～0.896 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其回歸方程為：Y=1440X-0.3503，r=0.9999。

2.6 對照品純度考察

分別精密稱取芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品，用流動(dòng)相溶解，制成每1 mL含量為2.58 mg和2.36 mg的對照品溶液，吸取20 μL注入高效液相色譜儀，按面積歸一化法測定純度。結(jié)果表明，芍藥內(nèi)酯苷對照品純度為98.51%，RSD為0.22%；芍藥苷對照品純度為98.61%，RSD為0.18%。

2.7 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

精密稱取芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算RSD分別為1.2%，0.94%。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品溶液及供試品依法制備成供試品溶液，在0、24、48小時(shí)內(nèi)依法測定。結(jié)果表明，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷對照品溶液和供試品溶液在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為0.67%，0.95%；0.97%，0.61%。

2.9 樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批次白芍藥材6份，按上述方法測定芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷含量。測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷的平均含量分別為0.75%、3.13%，RSD分別為1.27%，1.32%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1 0 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批次白芍藥材0.05 g，按樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算芍藥內(nèi)酯苷含量為7.48 gkg-1，分別精密加入芍藥內(nèi)酯苷對照品0.358 mg，按供試品溶液制備方法及上述高效液相色譜條件操作，測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，芍藥內(nèi)酯苷平均回收率98.18%，RSD%為1.78%。結(jié)果見表1。

表1 芍藥內(nèi)酯苷回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批次白芍藥材0.05 g，按樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算芍藥苷含量為31.30 gkg-1，分別精密加入芍藥苷對照品1.502 mg，按供試品溶液制備方法及上述高效液相色譜條件操作，測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，芍藥苷平均回收率為98.26%，RSD%為1.25%。結(jié)果見表2。

表2 芍藥苷回收率實(shí)驗(yàn)

2.1 1 樣品含量測定結(jié)果

從白芍藥材的主要產(chǎn)地（浙江、安徽、四川）收集多批次未經(jīng)硫磺熏制加工的白芍藥材樣品，按上述含量測定方法進(jìn)行含量測定。結(jié)果表明芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷含量分別不少于0.75%和2.71%，平均值分別為0.95%和2.93%。結(jié)果見表3。

表3 白芍藥材含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 氧化芍藥苷干擾芍藥內(nèi)酯苷含量測定

參考以往文獻(xiàn)報(bào)道，采用下述3種流動(dòng)相進(jìn)行高效液相色譜法檢測，方法①：采用中國藥典2010版一部白芍藥材芍藥苷含量測定項(xiàng)下流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液（14:86）；方法[7]②：采用甲醇-水（30:70）為流動(dòng)相[8]；方法③：采用中國藥典2010版一部赤芍藥材芍藥苷含量測定項(xiàng)下的流動(dòng)相甲醇-0.05molL-1磷酸二氫鉀溶液（40:65）[9]。結(jié)果見圖2。方法①和②的色譜圖均為兩個(gè)峰，但芍藥內(nèi)酯苷加樣回收率不符合規(guī)定，說明可能該方法不能準(zhǔn)確測定芍藥內(nèi)酯苷；方法③色譜圖為三個(gè)峰，芍藥內(nèi)酯苷芍藥苷之間有一個(gè)色譜峰且和芍藥內(nèi)酯苷不能完全分離，調(diào)整流動(dòng)相中有機(jī)相和水相的比例亦無法分離；同一樣品，在芍藥苷峰面積近似的情況下，方法③芍藥內(nèi)酯苷和該未知成分的色譜峰面積之和與方法①和②芍藥內(nèi)酯苷面積基本相等。結(jié)果表明在以上條件下，白芍藥材中含有對芍藥內(nèi)酯苷檢測有干擾的成分。經(jīng)與氧化芍藥苷對照品進(jìn)行對照，確定此干擾成分為氧化芍藥苷。

3.2 采用甲醇與適宜pH的鹽溶液組成的流動(dòng)相可以同時(shí)測定芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷

對芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷是同分異構(gòu)體，但芍藥內(nèi)酯苷具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，極性比芍藥苷大；氧化芍藥苷比芍藥苷多一個(gè)酚羥基，極性也比芍藥苷大。而氧化芍藥苷色譜行為易受pH影響，可利用酸堿性使其與芍藥內(nèi)酯苷分離。

流動(dòng)相采用甲醇-不同pH的磷酸-磷酸鹽溶液，配制含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和氧化芍藥苷的對照品溶液，以3個(gè)色譜峰的分離度為指標(biāo)，對流動(dòng)相的pH進(jìn)行考察。結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，改變流動(dòng)相pH，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的分離度沒有明顯改變，而氧化芍藥苷隨流動(dòng)相pH升高，保留時(shí)間縮短；反之，pH降低，保留時(shí)間延長。確定選用pH為4.2的流動(dòng)相，可使3個(gè)色譜峰完全分離，并可節(jié)省檢測時(shí)間。

芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷均為白芍中含量相對較高的單萜類成分，目前2010年版《中國藥典》只規(guī)定了白芍藥材和飲片中的芍藥苷的含量，未規(guī)定芍藥內(nèi)酯苷的含量。本研究為確定白芍藥材中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量提供了方法，對于白芍藥材、飲片或制劑生產(chǎn)的質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義。

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