夏天無總生物堿滲透泵控釋片中總生物堿的純化工藝研究

李杰，尹蓉莉，李東芬，呂懿平，趙明琴

夏天無系罌粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens（Thunb.）Pers.的干燥塊莖，具活血止痛、舒經活絡、祛風除濕等功效。主治高血壓、腦血管引起的中風偏癱，并對風濕性關節炎、坐骨神經痛、小兒麻痹后遺癥等有較好的作用，其主要活性成分為生物堿類。將夏天無總生物堿制成滲透泵控釋制劑可以減少服用次數，增加病人適應性，減少藥物在體內的峰谷現象，同時提高藥物的安全性、有效性、適應性和可控性。本實驗旨在優選出一種適合分離純化夏天無總生物堿的大孔樹脂，并對優選出的大孔樹脂分離夏天無總生物堿時的工藝條件及參數進行研究，實驗結果表明篩選出的工藝簡單可行，能夠滿足夏天無總生物堿滲透泵控釋片制劑的生產需求。

1 實驗儀器與材料

RE-53C旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-DIII型循環水式真空泵 (浙江黃巖求精真空泵廠)；79HW-1恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)；BP61型電子分析天平(上海精科儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械七廠）；UV1100紫外/可見分光光度儀（上海天美）；DL-720D 數控超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；F-160型粉碎機（北京光明醫療儀器廠）：夏天無藥材（亳州市安東藥業有限責任公司）、原阿片堿對照品(110853-200201)由中國藥品生物制品檢定所提供；95%乙醇、濃鹽酸、氯仿、溴甲酚紫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（成都市科龍化工試劑廠）；D101、AB-8、HPD722、HPD400、X-5型大孔吸附樹脂（滄州寶恩化工有限公司）。

2 方法與結果

2.1 夏天無總生物堿含量測定方法[1]

酸性染料比色法：酸水溶解樣品，以溴甲酚紫作離子對，用磷酸鹽緩沖液作水相，氯仿為有機相提取夏天無總生物堿與溴甲酚紫形成的呈色離子對，以原阿片堿為對照品，比色法測定夏天無總生物堿。

2.2 夏天無提取液的制備

將夏天無藥材粗粉1 kg，用1%HCl 溶液10 L作為溶劑，充分浸漬48 h后，進行滲漉操作，得到總堿提取液。

2.3 大孔樹脂預處理

將大孔樹脂用95%的乙醇浸泡24 h，使其充分膨脹，濕法裝柱，然后用95%的乙醇液洗至流出液加適量純水無白色渾濁現象，再用去離子水洗凈乙醇，直至流出液無渾濁為止。

2.4 樹脂型號的篩選

取過量夏天無提取液5份各150 mL，置具塞錐形瓶中，分別加入5種型號的大孔樹脂(D101、AB-8、X-5、HPD722、HPD400)各3 g，每10 min振搖一次，振搖2 h，靜置過夜，使達飽和吸附。過濾大孔樹脂，分別取各樹脂吸附后的溶液測定總生物堿的含量。再取吸附飽和的樹脂，分別加入95%乙醇，振搖2 h，靜置過夜，濾過，分別測定濾液中總生物堿的含量。計算夏天無總生物堿的提取率（解析后所得的總生物堿量與原提取液中總生物堿量的比值）。實驗結果見表1。

表1 5種大孔樹脂對夏天無總生物堿的提取率

由上述試驗結果可知，HPD722型大孔樹脂分離純化夏天無總生物堿提取率較高，故確定選用HPD722型大孔樹脂。

2.5 最大上樣量的考察

將處理完畢的HPD722濕樹脂裝柱，使樹脂柱的徑高比約為1∶8（r=1.5cm，V=20ml），將滲漉液上樣，收集流出液，分別測定每個床體積(Bed Volume,BV)流出液中總堿的濃度，繪制出總堿的泄漏曲線。結果見圖1。

上述試驗結果表明，總生物堿在第8份時出現較大泄漏，所以確定最大上樣量為7倍柱體積。

2.6 上樣流速考察

取5份經預處理的HPD722型濕樹脂，按“2.5”項確定的方法上樣，分別以1 BVh-1、2 BVh-1、3 BVh-1、4 BVh-1的流速上樣，收集柱后液，測定7份柱后液中總生物堿的含量，計算總生物堿吸附量。結果見表2。

表2 總生物堿吸附量/mg

由結果可知，隨著流速的增大，大孔樹脂對總生物堿吸附量有減小的趨勢，但1 BVh-1、2 BVh-1、3 BVh-1相差不大，為節省成本，確定上樣流速為3 BVh-1。

2.7 雜質洗脫劑用量的考察

取3份經預處理的HPD722型濕樹脂，按“2.5”和“2.6”項確定結果上樣，分別用去離子水、0.2% 氨水以1 BVh-1進行洗脫，每1 BV接收1份，測定總生物堿的含量，同時觀察洗脫液的顏色，確定洗脫劑的用量。結果見表3。

表3 兩種雜質洗脫劑總生物堿含量/mgmL-1

表3 兩種雜質洗脫劑總生物堿含量/mgmL-1

序號 1 2 3 4 5 6去離子水 0.847 1.044 1.166 1.077 0.989 0.910 0.2% 氨水 0 0 0 0 0 0

由結果可知，去離子水洗脫時有部分生物堿損失，而0.2%氨水能保證生物堿不被洗脫下來，所以選定0.2%氨水為雜質洗脫劑。通過觀察去離子水洗脫到6個柱體積后，洗脫液顏色已較淺，水溶性雜質基本上已經洗掉，確定雜質洗脫劑用量為6個柱體積。

2.8 洗脫劑濃度及用量的選擇

取3份經預處理的HPD722型濕樹脂裝柱，按“2.5”、“2.6”和“2.7”項確定結果上樣并洗脫雜質，分別以55%乙醇、75%乙醇和95%乙醇洗脫吸附在樹脂柱上的總生物堿，每1 BV接收1份，檢測總生物堿的含量，以洗脫液中總生物堿含量為指標，確定乙醇濃度及用量。結果見表4。

表4 3種洗脫劑中總生物堿含量/mgmL-1

表4 3種洗脫劑中總生物堿含量/mgmL-1

序號 1 2 3 4 5 6 7 55%乙醇 3.934 1.313 2.136 0.431 0.347 0.288 0.263 75%乙醇 4.763 0.926 0.910 0.733 0.872 1.632 0.889 95%乙醇 4.077 4.813 2.359 0.750 0.300 0.032 0.000

由結果可知，洗脫6個柱體積時，95%乙醇總生物堿含量已經很低，55%乙醇和75%乙醇仍含有一定量總生物堿，考慮到成本，確定總生物堿洗脫劑為95%乙醇，洗脫體積為5個柱體積。

2.9 洗脫速度的考察

取經預處理的HPD722型濕樹脂4份，按前幾項下確定結果上樣并洗脫雜質，用5倍柱體積的95%乙醇分別以0.5、1、1.5、2BVh-1的流速洗脫，收集洗脫液，測定其中總生物堿的含量，計算洗脫率。結果見表5。

2.1 0 純化工藝驗證

取夏天無粗粉3kg滲漉提取，取滲漉液平均分成3份，按最佳工藝經大孔樹脂分離純化，減壓回收乙醇，真空干燥后得到總堿粉末。經測定，3份精制物中總生物堿含量分別達到：77.2%、74.8%、75.5%，說明工藝穩定可行。

3 結論

綜上考察，5種大孔樹脂中，HPD722最適合分離夏天無總生物堿，最佳工藝條件為：上樣量為7BV；上樣流速為3 BVh-1；0.2%氨水液6BV洗脫雜質；95%乙醇洗脫總生物堿，洗脫體積為5BV，洗脫速度為1 BVh-1。采用本實驗確定的工藝，分離純化后的總生物堿含量可達70%以上，滿足夏天無總生物堿滲透泵控釋片的制劑需求。

[1] 廖靜,梁文藻.酸性染料比色法測定不同產地夏天無中總生物堿的含量[J].中草藥,1993,24(7):354.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) [S].北京:中國醫藥科技出版社,2010年.

[3] 趙大洲,戴勝軍.大孔樹脂分離夏天無總生物堿的研究[J].中成藥,2006,28(2):182.