大孔吸附樹脂法富集黃藤生物堿提取物的工藝研究

陳鴻平，程貝，劉友平，彭成

黃藤為防己科植物黃藤Fibraurea recisa Pierre.的干燥藤莖，味苦、性寒，有清熱解毒瀉火通便的功效，常用于熱毒內盛，便秘，瀉痢，咽喉腫痛，目赤紅腫，癰腫瘡毒[1]。黃藤主要含鹽酸巴馬汀、藥根堿等生物堿成分。鹽酸巴馬汀即黃藤素，是從黃藤藥材中提取純化得到的生物堿，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗炎、增加白細胞吞噬功能等藥理作用，是黃藤素片、黃藤素注射液等制劑的原料藥。黃藤素的傳統制備工藝為：采用鹽析法從酸水提取液中得到黃藤粗堿，再經結晶法精制得到，但該方法周期長、收率較低，且僅得到鹽酸巴馬汀成分，其他生物堿成分均丟失。因此本文首次采用大孔吸附樹脂法富集藥材酸水提取液中生物堿部位，再經吸附色譜法分離得到黃藤素和藥根堿鹽酸鹽。此純化工藝提高了黃藤素的含量和收率，同時還可分離得到藥根堿鹽酸鹽，為藥材資源綜合利用奠定了基礎。

1 儀器和材料

儀器：島津LC-10A高效液相色譜儀；島津工作站（日本島津公司）；島津SPD-10A紫外檢測器；色譜柱Hypersil BDS C18（5 μm，4.6×250 mm），大連依利特；BUG25-12超聲波清洗機（220V，50KHZ，必能信超聲（上海）有限公司）；塞多利斯電子分析天平BP211D（十萬分之一），BP121S（萬分之一）(北京賽多利斯科學儀器有限公司)。

材料：甲醇（色譜純，TEDIA公司），乙腈（色譜純，TEDIA公司），水為超純水，苦味酸（分析純AR，天津市科密歐化學試劑開發中心）；乙醇等其它試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）。鹽酸巴馬汀對照品：中國藥品生物制品檢定所（批號：110732-200506，含量測定用）；鹽酸藥根堿：中國藥品生物制品檢定所（批號：0733-200005，含量測定用）。黃藤藥材于2006年5月購自云南省紅河洲金平縣金沙鎮；大孔吸附樹脂（D101型，天津農藥股份有限公司樹脂分公司）；大孔吸附樹脂（AB-8型，南開大學化工廠）。

2 方法與結果

2.1 樹脂的預處理與再生

用95%乙醇浸泡，不少于12 h，裝柱， 95%乙醇洗脫至流出液與水（2∶1）混合不呈白色混濁時即可，再以蒸餾水洗至無醇味，備用。再生時可先用10%氫氧化鈉溶液或10%鹽酸洗脫后，再按預處理的方法進行處理。

2.2 樹脂類型的選擇

據文獻報道[2～3]，D101型和AB-8型兩種樹脂對原小檗堿型生物堿具有較好的吸附和解析作用，且這兩種樹脂型號在工業生產中較為常用。所以，本實驗選用這兩種大孔吸附樹脂為考察對象，對純化黃藤生物堿進行了研究。兩種大孔吸附樹脂物理性質見表1。

2.2.1 沉降密度的測定 樹脂含水量及沉降密度影響到裝柱體積，測定方法：將各型樹脂在70℃烘干至恒重，取適量稱重(W)，用95%乙醉浸泡充分溶脹，再用蒸餾水洗凈乙醇，待樹脂在水中沉降完全后測定其體積（V），按公式p=W/V計算樹脂沉降密度。測定結果見表1。

表1 D101型和AB-8型兩種樹脂物理性質

2.2.2 靜態吸附容量的考察 取經預處理的D101型和AB-8型樹脂10 mL，置具塞磨口錐形瓶中，精密加入黃藤提取液250 mL（鹽酸巴馬汀含量為1.67 mgmL-1），置恒溫水浴振蕩器上振蕩24 h，使其充分吸附后，過濾，再用少量蒸餾水洗樹脂，合并濾液并定容至250ml，采用HPLC法測定濾液中鹽酸巴馬汀的含量。按下式計算兩種樹脂在室溫下的靜態吸附容量(mgmL-1)。結果見表2。

表2 D101型和AB-8型兩種樹脂靜態吸附容量

2.2.3 靜態洗脫性能的考察 取上述吸附飽和的兩種樹脂，用蒸餾水洗至Mollish反應呈陰性，再加入95%乙醇250 mL，置恒溫水浴振蕩器上振蕩24 h，過濾，再用少量乙醇洗樹脂，合并濾液并定容至250 mL，按HPLC法測定濾液中鹽酸巴馬汀的含量。按下式計算各樹脂在室溫下的靜態解吸率(%)。結果見表3。

表3 D101型 和AB-8型兩種樹脂靜態解吸率

根據靜態吸附性能的考察結果，D101型和AB-8型兩種樹脂對鹽酸巴馬汀成分都具有良好的吸附和解吸性能。D101型樹脂吸附解吸性能稍優于AB-8型樹脂，因此，本實驗選用D101型大孔吸附樹脂純化黃藤中生物堿部位。

2.3 吸附流速的考察

平行取藥材提取液4等份，每份600 mL，上樣于經預處理的樹脂柱（D101型樹脂60 mL，柱徑:柱高=20 mm×200 mm），吸附流速分別控制為1, 2,3, 4 BVh-1（BV為柱床沉降體積），收集流出液，HPLC法測定流出液中鹽酸巴馬汀含量，按下式計算樹脂的動態吸附容量，結果見表4 。

表4 吸附流速對動態吸附容量的影響

2.4 洗脫溶媒的選擇

平行取同藥材提取液7等份，每份700 mL，依法上柱，分別用蒸餾水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇洗脫，洗脫速度控制在1～2 BVh-1之間，收集洗脫液至5 BV，HPLC法測定各洗脫液中鹽酸巴馬汀的含量，計算洗脫率，結果見表5。

表5 各洗脫溶媒的洗脫效果比較

結果表明：① 蒸餾水對巴馬汀成分有洗脫作用，用蒸餾水洗脫時，收集洗脫液至1 BV時顏色逐漸變為黃色，至1.5 BV時用改良碘化泌鉀試液檢測出含有生物堿，說明用蒸餾水洗脫除去部分水溶性雜質時，蒸餾水的用量最好控制在1 BV左右。② 乙醇濃度達到40%以上，鹽酸巴馬汀的洗脫率達到了90%以上，說明解吸效果良好。

本實驗再以洗脫物中鹽酸巴馬汀含量為評價指標進行考察，將40%、50%、60%乙醇的洗脫液，回收乙醇，濃縮，蒸干，得干膏，按HPLC法測定干膏中鹽酸巴馬汀含量。結果見表6。

表6 洗脫物中鹽酸巴馬汀含量比較

由上述結果可知，40%乙醇的洗脫物，鹽酸巴馬汀含量最高；所以本實驗以鹽酸巴馬汀的洗脫率和洗脫物中含量綜合考慮，選擇40%乙醇為洗脫溶媒。

2.5 洗脫溶媒用量的考察

取藥材提取液3000 mL，依法上柱，洗脫速度控制在1～2 BVh-1，先用1 BV的蒸餾水洗脫，用改良碘化泌鉀試液檢測無生物堿反應；再用40%乙醇洗脫，以0.5 BV份收集洗脫液，按HPLC法測定各流份中鹽酸巴馬汀含量，計算其洗脫率，結果見表7。

表7 洗脫溶媒用量的考察

圖1 洗脫曲線圖

由上述結果可知，40%乙醇洗脫液收集至2 BV，鹽酸巴馬汀的洗脫率已達80%以上，繼續洗脫，洗脫率增加不大，所以，確定用40%乙醇進行洗脫，收集洗脫液至2 BV。

2.6 洗脫液處理方法的考察

取提取液4000 mL（相當于200 g藥材），依法上柱，洗脫速度控制在1～2BVh-1，先用500 mL（1 BV）的蒸餾水洗脫，棄去；再用40%乙醇洗脫，收集洗脫液至1000 mL（2 BV），分為同等體積兩份。

2.6.1 處理方法一 取其中一份40%乙醇洗脫液500 mL，回收乙醇，濃縮，蒸干，得干膏，HPLC法測定干膏中鹽酸巴馬汀含量，結果見表8；采用HPLC梯度洗脫法比較干膏與黃藤藥材中生物堿成分的相關性，色譜圖見圖2。從圖2可知，藥材色譜圖中生物堿各峰均可在樹脂洗脫物中得到追蹤，說明藥材中的生物堿成分都能從D101型樹脂上洗脫下來，此種洗脫液處理方法能得到黃藤總生物堿。

圖2 黃藤藥材與樹脂洗脫物HPLC色譜圖

2.6.2 處理方法二 取另一份40%乙醇洗脫液500 mL，回收乙醇，繼續濃縮至100 mL（約原洗脫液的1/5），用鹽酸調pH值為2，靜置，過濾，沉淀在70℃以下烘干，粉碎； HPLC法測定沉淀中鹽酸巴馬汀含量，結果見表8。

表8 洗脫液處理方法比較

結果表明， 洗脫液處理方法一，使藥材中生物堿成分得到了有效富集，產物為總生物堿；方法二的鹽酸巴馬汀純化效果較好，產物中鹽酸巴馬汀含量達到80%以上。

故確定洗脫液的處理方法為：40%乙醇洗脫液，回收乙醇，繼續濃縮至原洗脫液的1/5，用鹽酸調pH為2，靜置，過濾，得黃藤素粗品，在70 ℃以下烘干。

2.7 濾液中藥根堿的利用研究

2.7.1 藥根堿含量測定 按HPLC梯度洗脫法測定上述洗脫液兩種處理方法所得產物中藥根堿含量，結果見表9。

表9 黃藤總生物堿和黃藤素粗品中藥根堿含量

結果表明，40%乙醇洗脫液，回收乙醇，繼續濃縮至原洗脫液的1/5，用鹽酸調pH為2，過濾，得黃藤素粗品，濾液中還含有較多的藥根堿成分。

2.7.2 濾液中藥根堿的利用研究 根據藥根堿的碘酸鹽溶解度較小的性質，采用碘化鉀鹽對此濾液進行沉淀，具體方法為：取濾液，加15%KI（W/V），靜置，使沉淀完全，過濾，沉淀在70 ℃以下烘干，粉碎，稱重，HPLC法測沉淀中鹽酸巴馬汀和鹽酸藥根堿含量，結果沉淀中鹽酸巴馬汀和鹽酸藥根堿的含量分別為54.61%和21.56%。表明，利用碘化鉀鹽對濾液進行沉淀，可得到含藥根堿成分的棕黃色粉末，說明利用這種方法可得到藥根堿提取物。

2.8 小試工藝驗證

取黃藤藥材2 Kg，依上述確定的D101大孔吸附樹脂純化工藝條件進行驗證試驗，結果見表10、11。

表10 黃藤素粗品小試工藝驗證結果

表11 藥根堿提取物小試工藝驗證結果

3 討論

3.1 綜上，確定D101大孔吸附樹脂純化黃藤生物堿工藝條件為：上樣藥液生藥濃度為0.5 mgmL-1，吸附流速控制在1～2 BVh-1之間；先用以蒸餾水1 BV洗脫，棄去；再以40%乙醇洗脫，收集洗脫液至2 BV；①將洗脫液回收乙醇，濃縮，蒸干，得黃藤總生物堿，或②將洗脫液回收乙醇，繼續濃縮至一定體積（約洗脫液的1/5），用鹽酸調pH為2，靜置，過濾，沉淀在70 ℃以下烘干，粉碎，即為黃藤素粗品；濾液，加15%KI（W/V）進行再次沉淀，靜置，過濾，沉淀在70 ℃以下烘干，粉碎，得藥根堿提取物。

3.2 D101大孔吸附樹脂為目前國內最常用的樹脂之一，是非極性、聚苯乙烯骨架的樹脂；鹽酸巴馬汀、藥根堿等為季胺型生物堿，極性較大，選用非極性樹脂進行純化，易于解吸附。從本實驗考察的結果看，D101樹脂對鹽酸巴馬汀成分具有較好的吸

附和解吸附性能，其靜態吸附率和靜態解吸率分別為75.25 mgg-1和97.96%；40%乙醇動態洗脫率高達80%以上；經D101樹脂純化后，黃藤藥材中生物堿得到了有效富集。

3.3 所建立的D101大孔吸附樹脂法工藝流程簡單、可行，鹽酸巴馬汀成分的轉移率為55%，比傳統工藝（約24%）高2.3倍，并且能得到藥根堿提取物。所以，采用D101大孔吸附樹脂富集純化黃藤藥材生物堿的方法，具有潛在的工業價值。

[1] 中 華人民共和國藥典委員會.《中華人民共和國藥典》一部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:288.

[2] 徐 曉宏,張鐵軍,廖茂梁,等.大孔吸附樹脂分離純化黃連總生物堿的工藝研究[J].中草藥, 2007,38(8):1167.

[3] 劉 映,李志忠.大孔吸附樹脂預分離后測定黃連及左金丸含量[J].中國藥師,2001,4(2):86.