多烯磷脂酰膽堿注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用

殷 彥 聶亞雄 朱云龍 尹 劍

南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 衡陽(yáng) 421001

流行病學(xué)調(diào)查研究［1］顯示：血液中亞油酸含量低，會(huì)增加缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。多烯磷脂酰膽堿注射液是從大豆中提取的磷脂精制而成，富含大量的多不飽和脂肪酸，主要成分有亞油酸（約占70%）、亞麻酸和油酸。目前該藥物主要用于治療各種類型的肝病，能否用于缺血性腦卒中的預(yù)防及治療，尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究根據(jù)大腦中動(dòng)脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO），探討多烯磷脂酰膽堿注射液對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品及主要試劑 多烯磷脂酰膽堿注射液（成都天臺(tái)山制藥有限公司提供，商品名：易善復(fù)），大鼠神經(jīng)元特異性烯純化酶ELISA試劑盒和腫瘤壞死因子－αELISA試劑盒（美國(guó)RD）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)條件 健康雄性Sprague－Dawley大鼠30只，體質(zhì)量250～300g，由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供（許可證號(hào)：湘SCXK2004－0009），自由進(jìn)食普通顆粒飼料，飲用自來(lái)水，動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度控制在20℃左右，正常晝夜節(jié)律。

1.3 栓線及腦缺血模型的制作

1.3.1 栓線的制作：采用單絲尼龍魚(yú)線，魚(yú)線直徑為0.24 mm，火燒線頭一端使之圓鈍直徑（0.32±0.02）mm，在距線頭18mm、20mm及25mm處用記號(hào)筆標(biāo)記，碘伏浸泡消毒后置于肝素納中備用。

1.3.2 腦缺血模型：參照Longa法［2］略加修改制作大腦中動(dòng)脈閉塞模型。大鼠稱質(zhì)量后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮、消毒，取右側(cè)旁正中切口，長(zhǎng)約2cm，鈍性分離肌肉，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及顱底附近向外走行的翼顎動(dòng)脈。于翼顎動(dòng)脈下套線（可不結(jié)扎），結(jié)扎頸外動(dòng)脈近分叉處及距分叉10mm處頸總動(dòng)脈，并在頸總動(dòng)脈近分叉處套線，用動(dòng)脈夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈，并在距分叉處5mm的頸總動(dòng)脈上用1mL注射器挑破一小口，插入栓線，通過(guò)分叉處時(shí)松開(kāi)動(dòng)脈夾，繼續(xù)向頸內(nèi)動(dòng)脈處推進(jìn)，并提拉翼鱷動(dòng)脈，調(diào)整栓線進(jìn)入方向，插入深度距分叉處約（18.2±0.5）mm，將栓線與頸總動(dòng)脈固定，徹底止血后縫合肌肉、皮膚，腹腔內(nèi)注射慶大霉素8000U／kg預(yù)防感染，放回飼養(yǎng)籠精心喂養(yǎng)。假手術(shù)組操作同上，但不插入栓線。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分 參照Longa5級(jí)評(píng)分法［2］：0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：不能自行行走，有意識(shí)障礙。選取神經(jīng)功能評(píng)分為2分者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)研究。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 將神經(jīng)功能評(píng)分為2分的18只腦缺血大鼠隨機(jī)等分為模型組、早期藥物干預(yù)組、晚期藥物干預(yù)組。模型組：持續(xù)給予與藥物等量的生理鹽水，共5 d；早期藥物干預(yù)組：造模評(píng)分后2h開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥3d，后2d給予等量生理鹽水；晚期藥物干預(yù)組：造模評(píng)分后2h開(kāi)始給予等量生理鹽水；術(shù)后第3天開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥3 d。術(shù)后第6天清晨進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分及標(biāo)本收集。藥物劑量：多烯磷脂酰膽堿注射液80mg／（kg·d）。

1.6 血清NSE和TNF－α含量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，心臟取血2 mL，4℃下靜置30min后，以1500r／min離心10min，收集血清，參照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)NSE和TNF－α含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，多重比較用LSD－t檢驗(yàn)；神經(jīng)功能評(píng)分以中位數(shù)及四分位數(shù)間距（M±QR）表示，采用秩和檢驗(yàn)及完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本間的比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果 參照Longa法［2］略加修改成功制作大腦中動(dòng)脈閉塞模型30只SD大鼠，術(shù)后神經(jīng)功能評(píng)分2分者18只，神經(jīng)功能評(píng)分3分6只，神經(jīng)功能評(píng)分4分4只，神經(jīng)功能評(píng)分1分2只，神經(jīng)功能評(píng)分0分0只。

2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，模型組、早期藥物干預(yù)組與晚期藥物干預(yù)組3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分

2.3 血清NSE和TNF－α含量 血清NSE含量和TNF－α含量比較，模型組與早期藥物干預(yù)組、晚期藥物干預(yù)組間，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；早期藥物干預(yù)組與晚期藥物干預(yù)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組血清NSE和TNF－α含量（ng／mL，）

表2 各組血清NSE和TNF－α含量（ng／mL，）

與模型組比較，＊P＜0.05

組別 n NSE TNF－α模型組6 69.95±4.61 3.05±0.34早期藥物干預(yù)組 6 55.96±4.76＊ 2.32±0.33＊晚期藥物干預(yù)組 6 56.59±3.64＊ 2.58±0.37＊

3 討論

NSE存在于全身各個(gè)系統(tǒng)中，主要分布于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌組織細(xì)胞胞漿和樹(shù)突的胞質(zhì)中。大量動(dòng)物模型及臨床實(shí)驗(yàn)證明，血液中NSE水平與腦梗死體積及腦損傷程度密切相關(guān)，是可用于判斷缺血性腦卒中急性期腦損傷程度及預(yù)后的可靠指標(biāo)［3－4］，本研究亦支持血液中NSE含量較神經(jīng)功能評(píng)分敏感。本研究參照Longa法［2］并略加修改制作MACO，對(duì)NSE的含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)論早期還是晚期對(duì)局灶性腦缺血大鼠注射多烯磷脂酰膽堿注射液，均能明顯降低NSE水平，我們有理由支持多烯磷脂酰膽堿注射液有助于缺血性腦損傷的治療。

眾所周知，在缺血性腦損傷中炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)起到推波助瀾的作用，其中TNF－α是最早產(chǎn)生并發(fā)揮作用的促炎細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素［5］，Manolescu BN［6］等采用病例－對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)：腦梗死患者血漿中TNF－α含量顯著高于正常人群，Tuttolomondo A［7］等也發(fā)現(xiàn) TNF－α促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，降低血管彈性，增加急性缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。Haile WB［8］等研究顯示：TNF－α增加 Bcl－2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，參與腦梗死發(fā)病過(guò)程。本研究通過(guò)檢測(cè)血漿中TNF－α含量，發(fā)現(xiàn)使用多烯磷脂酰膽堿注射液后，血液中TNF－α的含量明顯降低，表明該藥物能夠通過(guò)減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，在改善腦梗死預(yù)后中起到一定作用。

多烯磷脂酰膽堿注射液在缺血性腦損傷中的保護(hù)機(jī)制，可能還涉及：（1）減少氧化應(yīng)激，Aleynik SI等［9］發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸通過(guò)下調(diào)CYP2E1減少氧化產(chǎn)物，提升GSH，并能維持及提升膜蛋白相關(guān)蛋白及酶，包括NA＋－K＋－ATP酶和腺苷酸環(huán)化酶，維持體內(nèi)氧化－抗氧化防御體系的平衡；（2）降低甘油三酯和總膽固醇，減少動(dòng)脈粥樣硬化；（3）降低血壓［10］；（4）改善糖耐量［11］；（5）是體內(nèi)各種生物膜的重要組成部分，維持生物膜的穩(wěn)定性，保證體內(nèi)各種結(jié)構(gòu)及功能的完整性。

目前多烯磷脂酰膽堿注射液是消化科治療肝病的一種常用藥物，并未在神經(jīng)內(nèi)科對(duì)缺血性腦血管病中得到應(yīng)用，本研究實(shí)為常用藥物跨臨床科室間應(yīng)用的一種嘗試，由于樣本數(shù)量及實(shí)驗(yàn)條件等限制，我們無(wú)法檢測(cè)血液及腦脊液中多烯磷脂酰膽堿注射液的濃度，故該研究有一定的局限性。值得關(guān)注的問(wèn)題是多烯磷脂酰膽堿注射液的主要成分是亞油酸，其屬于（n－6）類脂肪酸，是促炎物質(zhì)花生四烯酸的前體物質(zhì)，多烯磷脂酰膽堿注射液在早期是否有促炎性作用，本研究尚未涉及。但目前尚無(wú)確切的證據(jù)表明（n－6）類脂肪酸類能夠拮抗（n－3）類脂肪酸的抗炎作用，且越來(lái)越多的研究支持（n－6）類脂肪酸與（n－3）類脂肪酸共同作用，能減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，降低炎癥反應(yīng)，且優(yōu)于其中任意一種［12－13］。

［1］Hiroyasu I，Shinichi S，Utako U，et al.Linoleic acid，other fatty acids，and the risk of stroke［J］.Stroke，2002，33：2086－2093.

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S et al.Reversal middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84－91.

［3］Wockt GC，Roberil RD.Neuron specific enolase serum level after cont roled corial impact injured in the rat［J］.Neurotrum，2001，8（5）：569－573.

［4］Kaca－Oryńska M，Tomasiuk R，F(xiàn)riedman A.Neuron－specific enolase and S100Bprotein as predictors of outcome in ischaemic stroke［J］.Neurol Neurochir Pol，2010，44（5）：459－463.

［5］GuY，Kuida K，Tsutsui H，et al.Activition of interferon－γinducing factor mediated by interlekin－1βconverting enzyme［J］.Science，1997，275（5297）：206－209.

［6］Manolescu BN，Berteanu M，Dumitru L，et al.Dynamics of inflammatory markers in post－acute stroke patients undergoing rehabilitation［J］.Inflammation，2010，30（1）：211－216.

［7］Tuttolomondo A，Di Raimondo D，Pecoraro R，et al.Immuneinflammatory markers and arterial stiffness indexes in subjects with acute ischemic stroke［J］.Atherosclerosis，2010，213（1）：311－318.

［8］Haile WB，Echeverry R，Wu F，et al.Tumor necrosis factorlike weak inducer of apoptosis and fibroblast growth factor－inducible 14mediate cerebral ischemia－induced poly （ADP－ribose）polymerase－1activation and neuronal death［J］.Neuroscience，2010，171（4）：1256－1264.

［9］Aleynik SI，Leo MA，Takeshige U，et al.Dilinoleoylphosphatidylcholine is the active antioxidant of polyenylphosphatidylcholine［J］.Investig Med，1999，47：507－512.

［10］Folsom AR，Ma J，McGovern PG，et al.Relation between plasma saturated fatty acids and hyperinsulinemia［J］.Metabolism，1996，45：223－228.

［11］Van Dam RM，Rimm EB，Willett WC，et al.Dietary patterns and risk for type 2diabetes mellitus in U.S.men［J］.Ann Intern Med，2002，136：201－209.

［12］Pischon T，Hankinson SE，Hotamisligil GS，et al.Habitual dietary intake of n－3and n－6fatty acids in relation to inflammatory markers among US men and women［J］.Circulation，2003，108：155－160.

［13］James AH，Cecilia JH.Brain uptake and utilization of fatty acids，lipids and lipoproteins：Application to neurological disorders［J］.J Mol Neurosci，2007，33：2－11.