針刺抑制幼鼠HIBD腦組織神經細胞凋亡的實驗研究★

祁巖超 劉振寰 柴鐵劬 唐純志

1)廣州醫學院附屬腫瘤醫院(廣州醫學院腫瘤研究所) 廣州 510095 2)廣州中醫藥大學附屬南海婦產兒童醫院 南海 528200 3)廣州中醫藥大學針灸推拿學院 廣州 510405

細胞凋亡,又稱程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD)。研究已經證實,在腦組織缺血缺氧(hypoxicischemic brain damage,HIBD)時除缺血區神經元的壞死外還存在某些易損區內神經元選擇性細胞凋亡,故在防治HIBD時,阻止細胞死亡,還是抑制細胞凋亡,均具有重要的治療意義。各種圍產期因素引起的HIBD,是導致兒童神經系統傷殘,引起腦性癱瘓的常見原因之一。由于HIBD導致腦血流減少和腦組織生化代謝改變,引起腦組織一系列病理改變,如皮質梗死,丘腦、基底節和間腦等部位深部灰質壞死,腦干壞死,腦室周圍或腦室內出血以及腦白質病變等。本實驗模擬HIBD的病理改變,通過針刺的早期及超早期干預,觀察針刺對新生幼鼠 HIBD腦神經細胞凋亡的抑制作用,探討針刺對腦癱的早期康復的可行性及作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物選擇 7 d齡新生SD幼鼠85只(由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供,清潔級),雌雄各半,體質量11.5～18.4 g,平均(12.6±2.1)g,鼠飼養環境:清潔級動物實驗室,溫度22～26℃,相對濕度60%～80%,日光燈照射,定時通風換氣,常規標準大鼠顆粒飼料喂養。造模前翻身、平衡、爬行功能測定均無異常。

1.2 模型制作和分組方法 模型制作參照文獻[2]并加以改進;將成功的模型動物隨機分為3組:A組:HIBD+針刺Ⅰ組,B組:HIBD+針刺Ⅱ組,C組:HIBD組;另設假手術組D組,每組24只。

1.3 針刺處理和針刺方法 取穴,定位參照《實驗針灸學》[3],HIBD+針刺I組手術后24 h開始針刺,前7 d僅針四肢部穴位,第8天開始加針頭部穴位。HIBD+針刺Ⅱ組手術后第8天開始針刺,頭、體針同步。具體針刺方法同“針刺對幼鼠HIBD腦組織發育及NGF蛋白表達的實驗研究”[4]。

1.4 觀察指標 (1)海馬錐體層CA1區錐體神經元個數:實驗動物于缺血缺氧后21 d處死、取腦,觀察腦的大體變化;雙側腦組織分別稱質量;稱取腦質量的腦組織,經中性甲醛固定后,按嘴側至尾側方向,從胼胝體膝至背側海馬作連續冠狀切片,片厚50 μ m,對照Paxinos和 Watson圖譜,確定上述切片背側海馬錐體層CA1區的中心部分,取3張連續腦片,以目鏡網格測試系統在10×40倍下計數1 mm長度范圍內的細胞數,取其平均值。(2)海馬錐體層CA1區及左大腦額葉皮質神經細胞凋亡個數:細胞凋亡檢測采用T UNEL法,按檢測試劑盒購說明進行(武漢博士德生物制品公司)。

1.5 細胞凋亡記數方法 用圖像分析儀在光鏡下計算每張腦片中的神經細胞凋亡數目。凋亡神經細胞計數方法:細胞核呈棕黃色者為陽性細胞,即凋亡細胞。每張大鼠腦缺血部位切片隨機取10個視野,計數凋亡細胞數,求其平均值。

1.6 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件包,計量資料以表示,率的比較采用 χ2檢驗,組間多均數比較采用方差分析(F-q檢驗)。

2 結果

2.1 腦大體檢查及質量的改變 HIBD后21 d,D組腦大體觀察未見明顯改變,A、B、C組在左腦半球大部分呈程度不等的萎縮,各組左大腦質量比較差異有統計學意義,其中C＜B＜A＜D,4組動物右腦質量差異不明顯。見表1。

2.2 海馬錐體層CA1區錐體神經元計數 見表2。

2.3 海馬錐體層CA1區及大腦額葉皮質神經元凋亡計數比較 見表3。

表1 腦質量的改變 (,mg)

表1 腦質量的改變 (,mg)

組 別 n 左大腦質量 右大腦質量HIBD+針刺I組 10 441.53±22.54 477.08±25.46 HIBD+針刺II組 10 411.53±20.91 471.12±24.54 HIBD組 10 345.75±21.02 470.5±30.86假手術組 10 473.16±13.54 474.2±29.37 F值 44.15 0.108 P值 ＜0.01 ＞0.05

表2 海馬錐體層CA1區錐體神經元計數(,個/mm2)

表2 海馬錐體層CA1區錐體神經元計數(,個/mm2)

組 別 n 左 右HIBD+針刺I組 10 106.37±10.46 140.34±20.51 HIBD+針刺II組 10 95.09±17.86 142.18±18.07 HIBD組 10 76.38±15.84 144.27±21.54假手術組 10 145.45±15.6 148.19±20.12 F值34.68 0.164 P值 ＜0.01 ＞0.05

如表2所示,4組右側海馬CA1區錐體神經元數差異無統計學意義(P＞0.05),左側差異有統計學意義(P＜0.05),其中C＜B＜A＜D。

表3 海馬錐體層CA1區及大腦額葉皮質神經元凋亡計數 (,個/高倍視野)

表3 海馬錐體層CA1區及大腦額葉皮質神經元凋亡計數 (,個/高倍視野)

組 別 n 左 右HIBD+針刺I組 10 5.04±1.21 4.86±1.15 HIBD+針刺II組 10 6.50±1.01 5.09±1.06 HIBD組 10 23.41±4.37 12.15±3.72假手術組 10 3.18±1.35 3.26±1.13

如表3所示,4組左側海馬CA1區錐體神經元凋亡數差異有統計學意義,其中D＜A＜B＜C,左側大腦額葉皮質神經元凋亡個數D＜A＜B＜C(P＜0.05)。

3 討論

由于腦性癱瘓發病原因、病變機制以及臨床癥狀都復雜多樣,缺血缺氧是許多腦癱腦損傷發生過程中所經歷的重要病理環節,因此,本研究在借鑒國內外經驗基礎上,建立了新生乳鼠HIBD窒息腦癱模型,開展針刺治療HIBD的有關機制研究。

本研究參照Rice的方法利用結扎頸動脈和缺氧制成缺血缺氧性腦病的動物模型[2]的方法,復制了該模型,通過行為測試觀察到其感覺和運動功能均存在一定障礙,至21 d時造模動物左腦大部分出現不同程度的萎縮,表明已成功建立了缺血缺氧性腦癱模型。

目前研究細胞凋亡的方法較多,最常用的特異性檢測凋亡細胞的方法為細胞原位標記法,亦為 TUNEL法,其基本原理是TdT可特異結合帶3’-OH的核苷酸片段,并形成由dUTP-biotin組成的脫氧核昔酸多聚體,后經帶有過氧化物酶的抗bi-otin抗體標記,經染色,陽性者提示細胞凋亡存在。

吳至鳳等[5]采用結扎孕鼠雙側子宮動脈,完全阻斷血供25min娩出胎鼠,制成腦損傷模型,將成功模型分為針刺組和模型組,每組8只,正常組剖宮取出胎鼠8只。正常組和模型組不予治療,針刺組于出生后7～30 d行針刺治療。30 d實驗結束后斷頭取腦,用TUNEL法檢測細胞凋亡,SABC法檢測腦組織Bcl-2和Bax蛋白表達。結果表明,針刺可以減少腦損傷大鼠腦組織神經細胞的凋亡,提高Bcl-2蛋白的表達,降低Bax蛋白的表達。提示針刺具有抗局灶性腦缺血時腦細胞凋亡的效應。

本實驗模擬HIBD病理改變,通過針刺百會、患側顳Ⅰ針、內關、曲池、足三里、涌泉穴,觀察針刺對 HIBD神經細胞凋亡的影響情況。結果在假手術組,大鼠腦內僅見少量TUNEL染色陽性細胞(圖 1、2);在 HIBD幼鼠腦缺血缺氧后,大腦皮質及海馬內可見大量的 TUNEL染色陽性細胞(圖3、4);在HIBD+電針Ⅰ組及 HIBD+電針Ⅱ組,大腦皮質及海馬內TUNEL染色陽性細胞顯著減少(圖5～8),與HIBD組相比,差異有統計學意義(P＜0.01)。且缺血+電針Ⅰ組神經細胞凋亡明顯少于缺血+電針Ⅱ組,2組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。提示針刺可抑制HIBD后腦內神經細胞的凋亡,對HIBD具有一定的保護作用,且越早干預效果越好。這可能與針刺阻止HIBD后脂質過氧化連鎖反應,從而抑制凋亡基因的啟動和促進抗凋亡基因的產生,達到抗凋亡的目的。

[1]張蘇明,方恩羽.缺血神經元分子生物學研究的現狀與展望[J].中華神經科雜志,1997,30(4):251-253.

[2]Rice.The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J].Annals of Neurology,1981,9(2):131.

[3]李忠仁,主編.實驗針灸學[M].北京:中國中醫藥出版社,2003:329.

[4]祁巖超,劉淑華,劉振寰,等.針刺對幼鼠 HIBD腦組織發育NGF蛋白表達的實驗研究[J].中國實用神經疾病雜志,2008,11(12):1-4.

[5]吳至鳳,溫恩懿,趙聰敏,等.針刺對發育期腦損傷大鼠腦組織細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響[J].重慶醫學,2010,39(21):2898-2903.