納米粒子基因復合體應用于脊髓損傷治療的實驗研究*

劉忠瑞,邵國喜,徐峰,劉欽毅,呼春

吉林大學第二醫院骨科,長春130041

細胞生物學和分子生物學的發展為脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的治療提供了新的手段,其中細胞移植和基因治療是兩種最有前途的方法。本實驗將殼聚糖納米粒子膠質細胞源性神經營養因子基因復合體(Complex of Chitosan Nanoparticle and Glial Cell Line Derived NeurotrophicFactor,CS-nano/pcDNA3.1/GDNF)轉入SCI部位,觀察GDNF的表達效率及對損傷脊髓的營養作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物:健康Wistar大鼠170只,體質量 200～ 250 g,雌雄不拘,隨機分為5組:A組(椎板切除+SCI+CS-nano/pcDNA3.1/GDNF,n=40),B組 (椎板切除+SCI+GDNF基因治療,n=40),C組(椎板切除+SCI+殼聚糖納米粒子,n=40),D組為單純損傷組(椎板切除+SCI,n=40),E組為對照組(椎板切除,n=10)。②主要材料:CS-nano/pcDNA3.1/GDNF已制備。

1.2 方法

1.2.1 SCI模型制備與給藥 SCI模型制備應用改良 Allen氏垂直重量打擊法(weight-drooping)法。應用質量為10 g的沖擊棒自10 cm長玻璃管垂直自由下落擊打脊髓背側圓形墊片,同時對脊髓造成打擊,沖擊棒直徑為3 mm。采用脊髓內直接注射法給藥,用微量注射器吸取3～4 μ L混合液,注入A～D組損傷部頭端的脊髓組織內,分不同方向選 3點注射,緩慢注射,留針 10～15 min。隨后緩慢取出微量注射器,逐層縫合傷口。

1.2.2 石蠟切片制作及HE染色 大鼠SCI后10 h處死,取脊髓組織,置福爾馬林固定液中固定24 h,用自來水沖凈固定液后浸于70%酒精中4℃保存。系列脫水后石蠟包埋,切片厚度4 μ m,常規 HE染色,取受損部脊髓做連續冰凍切片,片厚20 μ m,染色流程為:蒸餾水洗,Mayer蘇木精2 min,自來水藍化20 min,蒸餾水洗,1%伊紅15 min,蒸餾水洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡下觀察SCI情況。

1.2.3 大鼠脊髓組織的GDNF免疫組織化學染色 大鼠 SCI后 5、10、20、48 h分別處死大鼠……