華支睪吸蟲GST2-TP22.3融合蛋白的構建及其免疫原性初步研究*

李彩霞,王慧玲,胡旭初,余新炳

2.廣東省人民醫院肝膽外科,廣州 510080

3.中山大學中山醫學院寄生蟲學教研室,廣州 510080

華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)又稱肝吸蟲(liver fluke),其寄生在人體肝膽管內所引起的以肝膽病變為主的疾病稱為華支睪吸蟲病(clonorchiasis),又稱肝吸蟲病,是我國主要的食源性寄生蟲病之一[1]。2005年,華支睪吸蟲病被廣東省政府列為重點防治的地方病。2006年,華支睪吸蟲病被衛生部列為我國重點防治的寄生蟲病之一,因此,加強對華支睪吸蟲病的診斷和防治工作是目前的當務之急。

目前華支睪吸蟲病的診斷主要依靠病原學檢查和免疫學檢查。傳統的病原學方法是鏡檢糞便中的蟲卵,由于華支睪吸蟲排卵具有周期性且蟲卵很小,容易漏診,且操作費時費力,不適合流行病學調查;免疫學診斷的抗原主要是成蟲粗抗原,但粗抗原制備困難,來源有限,且交叉反應較嚴重。尋找高敏感性和高特異性的抗原成分,是解決華支睪吸蟲病早期快速準確診斷的關鍵。

有研究發現華支睪吸蟲成蟲谷胱甘肽轉移酶2(C.sinensis cy tosolic 28-kDaG lutathione transferases,Cs GST2)對華支睪吸蟲病具有重要診斷價值[2],但其敏感性不甚理想。華支睪吸蟲表膜相關蛋白能引起顯著的免疫保護,有良好的免疫原性,被視為潛在的診斷抗原[3]。本研究將華支睪吸蟲GST2和表膜相關蛋白編碼基因TP22.3先后克隆至原核表達載體pET32a(+),構建融合蛋白,獲得了高效表達并已純化,初步證明具有良好的免疫原性,為進一步研究其免疫反應性以及作為診斷抗原價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 文庫,質粒,菌株 華支睪吸蟲成蟲從市場購買的新鮮貓肝獲得,華支睪吸蟲成蟲cDNA質粒文庫由本室構建,其克隆載體為pBluescriptⅡSK的改造載體(即Eco RⅠ和NotⅠ之間的序列改造為S f iⅠA和S f iⅠB接頭序列)由上海聯眾科技研究院完成,大腸桿菌DH 5α、BL21及原核表達質粒pET32a(+)為本室常規保存。

1.1.2 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠(5～7 w),由中山大學實驗動物中心提供。

1.1.3 主要試劑和工具酶 Ex Taq酶(含dN TP),Eco R Ⅰ,SaLⅠ,K pnⅠ,Bam HⅠ和T4 DNA連接酶,DNA分子量標準(DL15 000,DL2 000)均購自TAKARA公司;異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG),購自美國Promega公司;Ni-IDA Agarose(cat No:69670)購自美國Novagen公司;蛋白分子量標準購自立陶宛MBI公司;DNA凝膠回收試劑盒,質粒純化試劑盒購自北京賽百盛基因公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG、DAB(3,3二氨基聯苯胺)顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;PVDF膜購自Millipore公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購自美國Sigma公司;TMB顯色試劑盒購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 基因識別和引物合成 將獲得的華支睪成蟲unigene進行Blastx分析,從中選取華支睪吸蟲GST2基因以及一個表膜相關蛋白基因(質粒編號為18D11),后者根據其分子量大小暫命名為華支睪吸蟲22.3kDa表膜相關蛋白(Cs TP22.3)。利用DNA club和 PCRdesign軟件,根據 Cs GST2、Cs TP22.3及pET32a(+)特異性酶切位點設計4條引物:Cs GST2上游引物 P1引入保護性堿基GCA和K pnⅠ酶切位點,下游引物P2刪除中止密碼子TGA,引入保護性堿基ATA和Bam HⅠ酶切位點;Cs TP22.3上游引物P3引入保護性堿基CGGC和EcoR I酶切位點,下游引物P4加入保護性堿基AAAC和SaLⅠ酶切位點。

P1:5′-GCAGGTACCATGAAACACAGACA -3′;P2:5′- ATAGGATCCCAGGACGGTCTCT-3′;P3:5′-CGGCGAATTCATGTGCGCGCTT-3′;P4:5′-AAACGTCGACTCATACCCACGGT-3′。引物由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.2.2 基因PCR擴增及鑒定 分別以P1、P2和P3、P4為引物,PCR擴增Cs GST2和Cs TP22.3基因片段。Cs GST2反應條件:預變性,95℃,3min;變性,94℃,1min;退火,57℃,50s;延伸 72℃,1min;30個循環。最后再72℃延伸8min。Cs TP22.3反應條件:預變性,94℃,5min;變性,94℃,30s;退火,56℃,30 s;延伸,72℃,90 s;35個循環。最后再72℃延伸8min。分別取PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 重組質粒pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3構建及鑒定 將Cs GST2基因擴增產物和質粒pET32a(+)經K pnⅠ和Bam HⅠ雙酶切后回收,連接,構建重組pET32a(+)-CS GST2質粒,經鑒定后,將Cs TP22.3基因擴增產物分別以Eco RI和SaLⅠ雙酶切,與同樣經雙酶切的pET32a(+)-Cs GST2連接,構建重組質粒pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3。轉化感受態大腸桿菌BL21/DE3,經鑒定重組成功后,將此菌接種于5m L LB培養液(含氨芐青霉素)37℃振搖過夜培養,分別取2m L菌液抽提質粒送測序鑒定及10μL重新接種入LB培養液(含氨芐青霉素)37℃振搖培養至 OD600=0.6,加入 IPTG至終濃度為1mm ol/L。37℃誘導表達4h后離心收集沉淀,加入1×SDS上樣緩沖液100μL,煮沸5min。取10μL裂解上清作12%SDS-PAGE電泳。同時設pET32a(+)質粒的誘導前后及重組質粒的誘導前做對照。

1.2.4 重組pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白的純化 大量培養、誘導表達、離心收集菌體(方法與1.2.3相同)。超聲破菌后 4°C離心13 000r/min×20min,收集包涵體沉淀。分別用0.15m ol/L的PBS、含2m ol/L尿素的PBS重懸包涵體、離心棄上清,然后將包涵體用含6mol/L尿素的PBS溶解變性后,離心收集上清,用0.45μm 濾膜過濾,參照Ni-IDA Agarose說明書,進行蛋白純化,收集蛋白洗脫液。將蛋白洗脫液于0.15mol/L的PBS(p H 7.4)中透析24h。

1.2.5 免疫大鼠血清的預吸附 取一個經pET-32a(+)質粒轉化的BL21/DE3單菌落,按照1.2.3方法培養1 000m L含pET-32a(+)質粒的大腸桿菌菌液,4℃、8 000r/min離心 20min,上清棄去,加入10m L PBS重懸沉淀菌體后冰上超聲破碎,4℃、13 000 r/min離心20 min,收集上清即 pET-32a(+)表達后BL21/DE3裂解液,-20℃保存備用。將1.2.4中pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白純化產物按照常規方法免疫SD大鼠,制備抗血清。將上述100μL大鼠血清中加入上述裂解液900μL,于4℃平緩搖振過夜。4℃、13 000 r/min離心20 min,收集上清。上清液再按1∶5比例加入以上裂解液,4℃平緩搖振過夜。4℃、13 000 r/min離心 20 min,收集上清,分裝成小份,-20℃備用。

1.2.6 Western b lotting檢測重組蛋白的免疫原性 將純化后的融合蛋白SDS-PAGE(12%)電泳完畢后采用半干電轉移方式,將蛋白條帶轉移至PVDF膜上。分別以1.2.5中處理過的免疫大鼠血清為一抗、1∶2000稀釋的羊抗大鼠IgG為二抗作用后,DAB顯色至出現目的條帶,去離子水終止反應。

2 結 果

2.1 重組 pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3質粒的鑒定 重組質粒pET32a(+)-Cs GST2及重組質粒pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3酶切鑒定結果正確,見圖1和圖2。

圖1 pET-32a(+)-Cs GST2重組質粒的PCR及雙酶切鑒定圖Fig.1 The identification of the pET-32a(+)-Cs GST2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymes

2.2 重組 pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白的表達、純化 SDS-PAGE證實在IPTG誘導下,將表達菌體進行超聲破碎后,經離子交換柱進行純化后獲得了純度較高的融合蛋白,在分子量大小約 62kDa處有一明顯蛋白表達條帶,與重組pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白的分子量大小一致,在其下方亦出現若干較弱蛋白表達條帶,分析可能為融合蛋白降解所致(見圖3)。

圖2 pET-32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3重組質粒的PCR及雙酶切鑒定圖Fig.2 The identification of the pET-32a(+)-Cs GST 2-Cs TP22.3 by PCR amplification and digestion with restriction enzyme

圖3 融合蛋白pET32a(+)-Cs GST2-Cs TP22.3的表達及純化Fig.3 Expression and purification of pET-32a(+)-Cs GST 2-Cs TP22.3

2.3 Western b lotting鑒定其免疫原性 經Western blotting鑒定發現,免疫大鼠血清能識別相對分子量為62kDa大小的反應條帶,與預期值相符。而含空質粒的大腸桿菌樣品及陰性鼠血清無任何反應帶出現,證實了該表達蛋白具有良好的免疫原性(圖4)。

3 討 論

目前,有關華支睪吸蟲的生長發育、致病機制以及高效快速診斷方法的研究正在逐步進行,這些研究的全面開展對華支睪吸蟲病的防治具有重要意義。傳統的病原學診斷因華支睪吸蟲排卵的周期性及蟲卵比較小,容易漏診,不適合大規模的流行病學調查。華支睪吸蟲抗原種類多而復雜,在宿主體內表達的數量、種類或時機可能隨病人的個體免疫背景和病程而異,因此,使用單一抗原進行檢測可能會導致敏感性低。因此對華支睪吸蟲病的血清學檢測,尚未發現敏感性與特異性均較滿意的檢測抗原。但隨著基因工程技術的發展,可依據需要對基因進行剪切、連接等可提高診斷的敏感性和特異性[4],這也是診斷試劑研制的發展方向。

圖4 純化產物被該蛋白免疫的大鼠血清識別Fig.4 The recombinant protein recognized by antisera of SD rat1:Protein marker,2:the purified product of pET-32a(+)with antisera of SD rat,3:The recombinant protein recognized by normal serum of SD rat,4:The recombinant protein recognized by antiseraof SD rat

蟲體表膜抗原因與宿主直接接觸產生致敏作用,誘發宿主產生免疫應答,并產生保護性免疫力,所以這類抗原在寄生蟲感染免疫中倍受重視[5-6],如日本血吸蟲表膜相關抗原在血吸蟲病疫苗發展和免疫診斷方面起重要作用[7]。華支睪吸蟲表膜蛋白(TP22.3)存在于囊蚴和成蟲等各期的表膜上,與宿主直接接觸,引起宿主較強免疫反應[3],有較高的診斷價值。但進一步研究卻發現,表膜蛋白在溶液中不穩定,易降解,嚴重限制了其作為診斷抗原價值。有報道指出采用融合谷胱甘肽轉移酶(GST)標簽的原核表達策略,可增加重組蛋白的穩定性[8]。GST是廣泛存在于各種生物體內的由多個基因編碼的、具有多功能的同工酶,谷胱甘肽轉移酶2是華支睪吸蟲疫苗理想的候選抗原,且對華支睪吸蟲病也具有重要診斷價值 ,但其敏感性仍不甚理想。因此,將GST2和TP22.3構建重組融合蛋白,可望成為診斷華支睪吸蟲感染的理想抗原。

在Cs GST2和Cs TP22.3的連接方面,本研究應用傳統的基因重組技術,選取特異性的限制性內切酶,成功的將Cs TP22.3和Cs GST2兩種華支睪吸蟲特異性抗原先后克隆至同一載體 pET-32a(+),充分保持了基因的連續性和完整性,使各個蛋白能夠較大程度地保持其原有的生物活性,既增加了Cs TP22.3的穩定性,又可以兼具兩種重組蛋白的免疫優勢和抗原特性,在保證特異性的基礎上提高檢測靈敏度。

為了除去可能存在的抗大腸桿菌其它蛋白的抗體和抗pET32a(+)中his標簽蛋白的抗體,盡可能消除使用大鼠血清進行免疫原性檢測時可能產生的背景,我們首先將血清與轉入了pET32a(+)的大腸桿菌BL21/DE3的裂解上清進行反復吸附,從圖4可以看出來,我們采取的這種血清吸附方法效果比較理想。后續試驗將使用腸激酶切除pET32a(+)質粒上的 his標簽蛋白,以獲得 Cs GST2-Cs TP22.3融合蛋白,為進一步研究其免疫反應性以及作為診斷抗原價值奠定基礎。

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