新疆維吾爾族和漢族非綜合征型感音神經(jīng)性聾患者線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變分析△

亞生江·托乎提 李彥華 徐紅霞 李卉 李惠武 羅永海 汪常偉 鄒廣華

新疆維吾爾族和漢族非綜合征型感音神經(jīng)性聾患者線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變分析△

亞生江·托乎提1李彥華1徐紅霞2李卉3李惠武3羅永海1汪常偉1鄒廣華1

目的 研究新疆地區(qū)維吾爾族（簡稱維族）和漢族非綜合征型感音神經(jīng)性聾患者線粒體DNA（mtDNA）12SrRNA A1555G突變頻率并比較其差異。方法 新疆地區(qū)非綜合征型遺傳性聾患者維族88例、漢族75例為患者組；正常人維族82例、漢族78例為正常對照組。抽取所有受檢者外周靜脈血，從白細(xì)胞中提取DNA，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增線粒體DNA目的片斷，Alw26I限制性內(nèi)切酶檢測A1555G點(diǎn)突變，對陽性病例的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序驗(yàn)證。結(jié)果 正常組中未檢出DNA12Sr RNA A1555G突變，患者組中檢出16例mtDNA A1555G點(diǎn)突變，12人為漢族（16.00%，12／75），4人為維族（4.55%，4／88），漢族與維族比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝6.001，P＝0.014）。結(jié)論 線粒體DNA12S r RNA A1555G突變是導(dǎo)致新疆地區(qū)非綜合征型遺傳性聾患者致病的主要原因之一，漢族高于維吾爾族。

非綜合征型； 基因； 突變； 遺傳性聾； 線粒體

據(jù)統(tǒng)計，有0.05%～0.10%的兒童出生時為極重度聾，同時，一半以上的先天性聾是由于遺傳因素造成的［1］。遺傳性聾患者中有30%為綜合征型聾，70%為非綜合征型聾［2］。線粒體DNA（mtDNA）12Sr RNA A1555G突變可以導(dǎo)致非綜合征型遺傳性聾，其突變的發(fā)生頻率在中國不同地區(qū)、不同民族之間有很大差異［3］。本研究旨在對中國新疆地區(qū)維吾爾族和漢族非綜合征型遺傳性聾患者進(jìn)行mtDNA 12Sr RNA A1555G突變的研究并比較其差異，為今后該地區(qū)維漢民族遺傳性聾的預(yù)防和治療提供可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集新疆喀什、阿克蘇、和田等部分邊遠(yuǎn)、貧窮、落后地區(qū)的非綜合征型遺傳性聾患者163例為患者組。其中維族88例，漢族75例；男82例，女81例；年齡3～22歲，平均15.20±2.90歲。同時，選擇該地區(qū)聽力正常人群160例為正常對照組，其中維族82例，漢族78例；男80例，女80例，年齡3～23歲，平均15.70±3.50歲。對全部研究對象由專業(yè)人員進(jìn)行純音測聽和聲導(dǎo)抗檢查，對不能配合的患者行耳聲發(fā)射、聽性腦干反應(yīng)檢查。耳聾分級［4］：輕度：20～40 dB HL；中度：41～70 d B HL；重度：71～95 dB HL；極重度：＞95 d B HL。163例耳聾患者中重度聾151例，中度聾12例。聾前有明確氨基糖苷（aminoglycoside antibiotic，Am An）類抗生素應(yīng)用史者32例，其中漢族15例，維吾爾族17例，用藥年齡多在半歲到2歲之間，用藥原因多為感冒、發(fā)燒和腹瀉，但具體用藥量不詳。

耳聾患者入選標(biāo)準(zhǔn)［5］：①雙側(cè)對稱性的、以高頻聽力下降為主的感音神經(jīng)性聾；②有家族史，家系中至少2人耳聾；③不伴其他任何癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有與國外種族聯(lián)姻家族史者；②外耳、中耳畸形；有可能導(dǎo)致傳導(dǎo)性聾病史，如有急慢性中耳炎、中耳或外耳手術(shù)史，聲導(dǎo)抗測試結(jié)果異常；③有其他明確的導(dǎo)致聽力下降的原因（如：細(xì)菌性腦膜炎、迷路炎、累及耳蝸的顳骨骨折等）；伴有全身疾病者（如：心臟病、糖尿病等）；④有影響聽力檢測結(jié)果的疾病（如：智力障礙者）；⑤診斷為進(jìn)行性耳聾的患者（如自身免疫性內(nèi)耳病、梅毒性內(nèi)耳疾病等）；⑥己經(jīng)明確為綜合征型聾患者（如：Waadrnebugr綜合征、Usher綜合征等）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集受檢者外周靜脈血2～4 ml，用酚／氯仿法從白細(xì)胞中提取基因組DNA（含線粒體DNA），應(yīng)用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳和分光光度計進(jìn)行純度和濃度鑒定。TE溶解，－20℃凍存。蛋白酶K、TE、50×TAE液、限制性內(nèi)切酶A1w26I及與其配套使用的Buffer均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2.2 線粒體DNA目的片斷的PCR反應(yīng) 以外周血白細(xì)胞DNA為模板，應(yīng)用Primer3軟件在線設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的引物5’CCCTGATGAAGGCTACAAAGTAAGCGC 3’（nt 1278－1304）；R：5’CAGCTATC ACCAGGCTCGGTAGGTTT 3’（nt 2018－1993）擴(kuò)增產(chǎn)物為741 bp。PCR反應(yīng)體系為50μl，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，65℃復(fù)性1 min，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，反應(yīng)終止后再72℃延伸10 min，4℃保存。取5μl進(jìn)行2%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3 Alw26I酶切分析 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物8μl，buffer 2 μl，Alw26I內(nèi)切酶0.5μl，補(bǔ)充雙蒸水至20μl，37℃水浴箱內(nèi)消化120 min，以2%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果。

1.2.4 DNA序列測定驗(yàn)證 對于經(jīng)酶切確定為陽性的病例，取相應(yīng)的PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序部完成，應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST在線比對測序結(jié)果，用DNAMAN軟件將產(chǎn)物序列與標(biāo)準(zhǔn)序列比對，找出堿基改變的位點(diǎn)，分析突變情況。12Sr RNA標(biāo)準(zhǔn)序列參照：NC＿011137。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。維漢民族mtDNA A1555G突變的陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)＜1時使用Fisher確切概率法，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果 mt DNA 12Sr RNA A1555G突變使原存在于線粒體基因1552～1556位的Alw26I酶切位點(diǎn)消失。有這種突變的PCR片斷，用Alw26I酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳仍為一條帶，而無此突變的擴(kuò)增片斷則被切割成278 bp和463 bp兩條帶（圖1）。對所有酶切呈一條帶的患者，再取PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行直接測序驗(yàn)證（圖2）。

圖1 PCR產(chǎn)物經(jīng)Alw26I酶切分析檢測mt DNA 12Sr RNA A1555G突變M：PCR分子量標(biāo)準(zhǔn)物（DL2000）；2、3、6、9、10：Alw26I酶切后的突變樣品，其中2、3、6為漢族，9、10為維族；其余為Alw26I酶切后的無突變樣品

2.2 基因突變檢測結(jié)果 正常對照組中未檢出mtDNA A1555G突變。163例耳聾患者中16例（9.82%，16／163）存在mtDNA A1555G突變，其中漢族12例（16.00%，12／75），維族4例（4.55%，4／88），漢族mtDNA A1555G突變檢出率顯著高于維吾爾族，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝6.001，P＝0.014）。這16例中，漢族8例有Am An應(yīng)用史，維族有3例。

3 討論

mtDNA突變是導(dǎo)致非綜合征型母系遺傳性聾的主要原因［6］，其突變還可以導(dǎo)致個體對致聾環(huán)境因素的易感性增加，其中以對Am An易感的mtDNA12Sr RNA A1555G點(diǎn)突變較為常見。1993年，Prezant等［7］首次證實(shí)線粒體DNA 12Sr RNA A1555G點(diǎn)突變與氨基糖苷類抗生素致聾患者的相關(guān)性，現(xiàn)在也已經(jīng)證實(shí)mtDNA A1555G突變和氨基糖苷類藥物誘發(fā)的耳聾密切相關(guān)［8］。本組患者中，16例存在mt DNA 12SrRNA A1555G突變者中即有11例有AmAn應(yīng)用史。

在我國，氨基糖苷類藥物性聾是導(dǎo)致新生兒先天性聾和成人后天性聾的主要原因之一，通過耳聾基因檢測確定為mt DNA 12Sr RNA A1555G突變陽性的患者，根據(jù)線粒體母系遺傳的特點(diǎn)，其所有母系家庭成員應(yīng)終身絕對禁止使用Am An。這樣，在明確病因的同時，大大降低了家族成員發(fā)生藥物性聾的危險性。

圖2 線粒體DNA1555位點(diǎn)序列分析箭頭所指為mt DNA 12Sr RNA A1555G突變位點(diǎn)

mtDNA A1555G突變在不同國家發(fā)病情況不同，甚至同一國家不同地區(qū)、不同民族的發(fā)病也不同。這除了社會經(jīng)濟(jì)因素外，可能與不同的遺傳背景有關(guān)。研究表明日本的NSHL患者中發(fā)現(xiàn)mtDNA A1555G突變的攜帶率為3.45%（11／319）［9］。歐洲中部德國、匈牙利、波蘭320例NSHL中mtDNA A1555G突變有4人，攜帶率為1.25%［10］。北歐丹麥則為2.4%（2／85）［11］。Li等［12］在美國辛辛那提的NSHL兒童中發(fā)現(xiàn)A1555G攜帶率為0.6%（1／164）。戴樸等［3］在對中國不同省份特教學(xué)校的2 016例NHSL患者mt DNAA1555G突變篩查中發(fā)現(xiàn)陽性病例57例，檢出率為2.83%。Malik等［13］在印尼的蘇拉威西島75名非綜合征型聾患者中檢測到A1555G陽性患者4例，A1555G攜帶率達(dá)5.3%，而劉曉雯等［14］報道甘肅A1555G突變陽性率為8.4%（67／802）。本研究顯示本組新疆地區(qū)漢族和維吾爾族非綜合征型性聾者mt DNAA1555G突變總陽性率為9.82%，而漢族陽性率相當(dāng)高，達(dá)16%。分析其高檢出率的原因主要是：①新疆地處祖國西北，屬于貧窮落后地區(qū)，醫(yī)療條件和水平落后，缺醫(yī)少藥，Am An具有價格低廉、抗菌譜廣、殺菌作用快等優(yōu)點(diǎn)，其使用相對較廣泛，在一定程度上提高了耳聾發(fā)生率，這些患者納入調(diào)查后提高了這一基因突變的檢出率；②也可能是人種、地域、氣候及飲食習(xí)慣等因素共同引起了新疆A1555G突變的高發(fā)生率；③新疆作為一個特殊地區(qū)，環(huán)境因素可能參與較多，而氨基糖苷類抗生素誘發(fā)或加重耳聾的程度使環(huán)境因素在耳聾的發(fā)病方面顯得更為突出［15］。線粒體單倍體型的不同也可能引起線粒體基因突變攜帶率的不同，進(jìn)而導(dǎo)致不同民族發(fā)病率的差異；④自身存在的抽樣誤差也可造成維漢兩民族不同的檢出率。本研究樣本量偏小，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

因此，有必要應(yīng)用基因診斷手段對高危人群或特定人群進(jìn)行mtDNA A1555G突變的普遍性篩查，為存在mtDNA A1555G突變者提供早期診斷、早期干預(yù)、早期治療方案及詳盡的遺傳咨詢；并利用分子遺傳學(xué)檢測手段對于母親孕期或新生兒進(jìn)行mtDNA A1555G突變的篩查，提高非綜合征型聾產(chǎn)前診斷的可能性，減少遺傳性聾的發(fā)生，并為探索相應(yīng)的基因治療方法提供理論依據(jù)。在未來的很長一段時間，Am An還將在醫(yī)療水平滯后地區(qū)繼續(xù)使用，所以預(yù)先發(fā)現(xiàn)對Am An耳毒性致聾的易感性個體就具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。從本研究可以看出，mt DNA A1555G在新疆地區(qū)有較高的突變率，漢族高于維吾爾族，在中國新疆地區(qū)開展維漢兩民族mtDNA 12Sr RNA A1555G突變的檢測工作顯得尤為重要。

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3 戴樸，劉新，于飛，等.18個省市聾校學(xué)生非綜合征性聾病分子流行病學(xué)研究（I）－GJB2 235de1C和線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變篩查報告［J］.中華耳科學(xué)雜志，2006，4：1.

4 王秋菊.關(guān)于非綜合征型遺傳性聾家系遺傳學(xué)及聽力學(xué)描述術(shù)語建議案［J］.中華耳科學(xué)雜志，2003，1：46.

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15 王秋菊，韓明鯤，劉曉雯，等.值得關(guān)注的線粒體12SrRNA C1494 T突變——藥物敏感致聾靶點(diǎn)［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2008，16：446.

（2010－05－11收稿）

（本文編輯 周濤）

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.019

R764.44

A

1006－7299（2011）01－0061－04

△ 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30860358）、新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（200721117）資助

1 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科（烏魯木齊 830000）； 2 新疆醫(yī)科大學(xué)2007級碩士研究生； 3 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研中心地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

李彥華（Email：liyanhua1953＠126.com）