內淋巴積水豚鼠模型制作

董昶 綜述 華清泉 劉陽 審校

內淋巴積水豚鼠模型制作

董昶1綜述 華清泉1劉陽2審校

自1861年法國學者Prosper Meniere首次報道了梅尼埃病以來，后人從病因、病理、生理、診斷、治療等各方面對其進行了大量的研究。1938年Hallpike首先通過梅尼埃病患者顳骨尸檢揭示了梅尼埃病的組織病理學特征為膜迷路積水。由于涉及倫理道德等問題，繼續研究梅尼埃病需要尋找一種與人耳結構相似且制作膜迷路積水簡便的動物。豚鼠聽覺靈敏且其顳骨與人類顳骨相似，已成為耳科學研究常用的實驗動物。本文就目前建立豚鼠膜迷路積水模型的原理、方法、成功率及特點等進行綜述。

1 減少內淋巴吸收誘導內淋巴積水

內淋巴液的產生和吸收是動態平衡的過程，此類模型制作原理是基于內淋巴囊是內淋巴液吸收的主要部位，通過直接阻斷內淋巴管和囊、破壞內淋巴囊周圍血管，間接影響內淋巴液吸收，從而導致內淋巴積水。

1.1 阻塞內淋巴管和囊致內淋巴積水

1.1.1 頂枕進路阻塞內淋巴管和囊 Kimura等［1］通過手術阻塞豚鼠內淋巴管和囊，首次在豚鼠體內復制出膜迷路積水模型，從而為研究內淋巴積水的內耳組織學、病理生理學等創造了一條全新的途徑。方法：豚鼠麻醉后作頭皮正中切口，切除枕骨大孔背側緣至人字縫的枕骨。然后在小腦處切開硬腦膜，巖骨近橫竇處小龕即內淋巴囊中部標記，用鉆頭鉆穿前庭導水管，破壞內淋巴囊后沿導管方向再繼續追進，最后在鉆孔內置入骨蠟，枕骨缺損處填塞明膠海綿，縫合皮膚。

1.1.2 后顱窩硬膜外進路阻塞內淋巴管和囊 為了解決上述制作方法創傷過大的不足，Konishi［2］創立了后顱窩硬膜外進路內淋巴囊導管阻塞術。方法：豚鼠麻醉后行顱頂正中切口，磨去術側枕骨暴露硬腦膜及乙狀竇，剝離硬腦膜至乙狀竇前緣，在前庭導水管顱內開口處切斷內淋巴囊。再用微電鉆沿前庭導水管方向鉆入，破壞骨內部分淋巴囊和部分內淋巴導管，然后填以骨蠟、明膠海綿，縫合切口。

王宜南［3］按照Kimura的方法制作豚鼠內淋巴積水模型，通過火棉膠切片比較不同術后存活時間豚鼠內淋巴積水的發生率，結果2～9天為58.3%，10～29天為78.3%，30～55天為100%，總計積水發生率為80.3%。之后陸續有學者報道手術方法制作內淋巴積水模型成功率可達100%。

通過手術方法制作豚鼠內淋巴積水模型的缺點是破壞性過大，造模所需時間較長。另外，臨床上發現只有37%的梅尼埃病患者存在解剖異常［4］，此法只能解釋這些存在顱內解剖異常影響內淋巴回流的現象，并非梅尼埃病的生理模型。其優點是造模成功率很高，是制作內淋巴積水的可靠方法。

1.2 破壞內淋巴囊周圍的血管致內淋巴積水 內淋巴囊的血液供應主要來自內耳的前庭后動脈和頸外動脈的分支—腦膜后動脈，靜脈回流則是通過橫竇。Lee［5］等通過切斷腦膜后動脈和前庭導水管外口上、下的乙狀竇制作出了內淋巴積水模型。方法：豚鼠麻醉后暴露橫竇的彎曲部分全長，然后縱行切開后顱窩的腦膜，腮蓋的凹陷骨龕即是前庭導水管外口的位置。將乙狀竇輕輕從骨溝中提起，結扎后切斷，用眼科燒灼器燒灼前庭導水管外口上下的乙狀竇。因腦膜后動脈與乙狀竇彼此靠近，故在切除乙狀竇的同時也切斷了腦膜后動脈。使用明膠海棉填補骨質缺損，縫合肌肉和皮膚。采用火棉膠切片觀察膜迷路積水程度，1～2個月后所有豚鼠都出現了耳蝸輕到中度內淋巴積水，球囊出現了中重度的積水，而橢圓囊呈現輕度積水。該方法制作內淋巴積水成功率高，缺點是過程稍繁瑣。

1.3 內淋巴囊遠端燒灼或全切法致內淋巴積水 Dunnebier［6］為了對內淋巴囊的破壞程度進行標準化，即僅僅導致內淋巴囊骨外部分遠側端輕度纖維化而創立了這兩種方法。①燒灼法：麻醉后豚鼠經顱后凹硬膜外徑路暴露術耳內淋巴囊，用硝酸銀燒灼內淋巴囊的遠側端，最后縫合切口。②全切法：切除乙狀竇和內淋巴囊遠端間的聯系并塞入小片乳膠片將其隔開，后塞入可吸收海綿，縫合切口。手術后23天，采用耳蝸組織切片觀察內淋巴積水程度，結果，燒灼法可致40%豚鼠出現輕度積水，且主要出現在頂回；全切法可致75%豚鼠出現中重度內淋巴積水，積水程度較一致。

作者認為這兩種方法的原理均是影響到了內淋巴囊的靜脈回流從而影響其對內淋巴液的吸收，其優點是組織破壞較少，內淋巴積水程度較為一致，缺點是成功率稍低。

2 增加內淋巴液的產生誘導內淋巴積水

傳統理論認為內淋巴液的產生受血管紋邊緣細胞和橢圓囊及半規管壺腹部的暗細胞膜上的Na／K泵控制。此類模型制作方法同樣是基于打破內淋巴液產生和吸收之間的動態平衡，通過各種激活劑激活Na／K泵，從而誘導內淋巴積水。

2.1 血管加壓素（或醛固酮）致內淋巴積水 Takeda［7］曾報道內淋巴積水導致的內耳功能紊亂患者的血漿中血管加壓素（VP）濃度增加，并與臨床癥狀相關。1998年Kumaga-

1 武漢大學人民醫院耳鼻咽喉－頭頸外科（武漢 430060）；

2 海軍總醫院全軍耳鼻咽喉－頭頸外科中心

通過血管加壓素（或醛固酮）誘導豚鼠內淋巴積水，過程簡單，時間短，成功率高，遺憾的是此法誘導的內淋巴積水轉歸尚未見相關文獻報道。

2.2 霍亂毒素致內淋巴積水 Lohuis等［10］通過外淋巴灌注霍亂毒素，使中階上皮細胞中的腺苷酸環化酶活化，從而產生大量c AMP，后者能誘導內淋巴液大量分泌致內淋巴積水。方法：暴露耳蝸后在耳蝸上鉆兩小孔，一個通向鼓階，另外一個通向底回的前庭階，先通過鼓階的孔向外淋巴液中灌注人工外淋巴液15分鐘，然后灌注含有牛血清蛋白和霍亂毒素的人工外淋巴液。灌注后4小時通過耳蝸組織切片觀察積水程度，結果實驗組前庭膜長度增加比（lR／d）較對照組有增加但尚無統計學差異。Feldman等［11］通過純化的霍亂毒素注射至耳蝸中階75分鐘后觀察到所有豚鼠內淋巴液體積明顯增加。此方法制作內淋巴積水所需時間短，成功率較高，但作者未對積水的持續時間及轉歸進行探討。

3 兩期法誘導內淋巴積水

Dunnebier［12］自創了兩期法（two－phase）制作豚鼠膜迷路積水模型，即同時增加內淋巴液的產生和減少回流制作。方法：豚鼠麻醉后經顱后窩硬膜外徑路暴露內淋巴囊，分離乙狀竇與內淋巴囊遠端間的聯系，使用小塊乳膠片將二者隔開，并用明膠海棉固定，縫合切口。術后第3周起醛固酮腹腔內注射，連續5天，3周后通過耳蝸切片觀察到33%豚鼠出現中度積水，50%出現重度積水，總成功率為83%。

兩期法制作出的內淋巴積水模型是一種動態模型，既有內淋巴囊遠端破壞后內淋巴液吸收減少的過程，也有醛固酮誘發內淋巴液分泌量輕度增加的過程，可解釋許多梅尼埃病的癥狀，如梅尼埃病患者聽力的波動性變化。手術導致內淋巴功能障礙主要影響耳蝸頂回致低頻聽力下降，醛固酮主要影響底回致高頻聽力下降。該新模型是研究梅尼埃病發病機理及治療方法較為理想的模型［12］。

4 免疫法誘導內淋巴積水

嚴格說來，免疫法誘導的內淋巴積水也是基于破壞內淋巴產生和吸收的動態平衡過程，但因許多學者提出內耳免疫的異常是梅尼埃病的病因之一，故將其單列。

4.1 鑰孔嘁血藍素免疫誘導致內淋巴積水 鑰孔嘁血藍素（KLH）是一種穩定的T細胞依賴性抗原，具有極強的免疫原性。Tomiyama［13］通過使用KLH中耳免疫誘導豚鼠內淋巴積水，探討了內淋巴囊的免疫中心作用。方法：豚鼠先通過全身KLH致敏，2周后再行全身加強免疫，之后通過微量移液器將KLH注入內淋巴囊行局部免疫。通過組織切片觀察球囊、橢圓囊和耳蝸的內淋巴積水程度，耳蝸內淋巴積水發生率在內淋巴囊免疫后第二天即達到100%，并持續至第七天，隨后積水的發生率又逐漸下降，在2個月后內淋巴積水發生率又逐漸升高。

通過KLH致豚鼠內淋巴積水的過程相對簡單且成功率非常高，內淋巴積水隨時間變化既可逆的部分，也有不可逆的部分，能夠模擬梅尼埃病的反復波動性發作，且有前庭紊亂的癥狀，如自發性眼震和冷熱試驗反應減弱。缺點是外淋巴液中產生了大量的炎性細胞，而梅尼埃病患者外淋巴液中沒有。

4.2 辣根過氧化物誘導內淋巴積水 1987年Sawada［14］通過使用辣根過氧化物酶（HRP）成功誘導出了內淋巴積水模型。方法：首先通過HRP與完全弗氏佐劑混合皮內注射免疫豚鼠，1周后通過微量加液器在內淋巴囊周圍注射少量的HRP，4～7天后采用同樣的方法行第二次局部加強免疫。通過耳蝸組織切片觀察積水程度，結果不同時間段處死的豚鼠中95%觀察到了內淋巴積水。此方法制作內淋巴積水，步驟簡單，成功率較高；缺點是第一次全身免疫后，未行局部免疫耳亦有可能出現內淋巴積水，故實驗耳與對照耳不能選用同只豚鼠。

4.3 其他免疫誘導法 譚長強［15］報道豚鼠同種內耳免疫抗原誘導豚鼠內淋巴積水成功率是100%，但翟所強［16］采用類似方法未觀察到耳蝸內淋巴積水，故此法穩定性差。王紅生［17］報道酵母多糖活化血清中的補體后誘導出了豚鼠內淋巴積水模型，但其成功率僅10%。Matsuoka（2003）通過直接向鼓階注射Ⅱ型膠原CB11肽段單克隆抗體制作出了內淋巴積水模型，其成功率是100%。

5 其他

Van Benthem［18］報道豚鼠腹腔內注射尼莫地平，內淋巴積水成功率約為40%。Valk［19］通過直接向中階注射人工內淋巴液的方法制作內淋巴積水模型。Flock［20］、Salt［21］報道利用噪聲或增加外淋巴靜態壓誘導出耳蝸內淋巴積水。Fukuda等［22］通過豚鼠巨細胞病毒（GPCMV）注射至內淋巴囊誘導出豚鼠內淋巴積水，其成功率高達100%。

將目前制作內淋巴積水豚鼠模型方法歸納為表1，可見，雖然內淋巴積水的動物模型制作方法多種多樣，但尚存在著如下問題：首先，無一種動物模型能夠真正吻合梅尼埃病的癥狀、體征、病理生理改變等指標，如梅尼埃病患者顳骨解剖中并未發現阻塞內淋巴管和囊的病理改變；無一種模型出現梅尼埃病患者的波動性聽力下降，前庭癥狀并未在所有模型動物中出現等，故實驗者應該根據不同的實驗目的、結合造模所需時間及成功率等因素來選擇不同的造模方法；其次，上述方法確認模型制作成功均是處死豚鼠后通過組織切片來判定，至今尚無一種確定活體內淋巴積水的特異方法，這樣不利于造模成功后下一步實驗的進行；最后，上述方法對內淋巴積水程度的劃分標準不一，有的采用Sperling標準［23］（前庭膜與骨壁有無接觸及前庭膜與螺旋板之間的角度），有的自立標準，這些問題都值得進一步深入研究。

表1 內淋巴積水豚鼠模型制作方法

1 Kimura RS，Schuknecht HF.Membranous hydrops in the inner ear of the guinea pig after obliteration of the endolymphatic sac［J］.Pract Otorhinolaryngol，1965，27：343.

2 Konishi S，Shea JJ.Experimental endolymphatic hydrops and its relief by interrupting the lateral semicircular duct in guinea pigs［J］.J Laryngol Otol，1975，89：577.

3 王宜南，劉兆華.用計算機圖像分析技術研究膜迷路積水［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，1996，31：139.

4 Schuknecht HF，Ruther A.Blockage of longitudinal flow in of the endolymphatic hydrops［J］.Euro Arch Otorhinolaryngol，1991，248：209.

5 Dunnebier EA，Segenhout JM，Wit HP，et al.Endolymphatic hydrops after total dissection or cauterization of the distal portion of the endolymphatic sac［J］.ORL，1996，58：217.

6 Lee KS，Kimura RS.Ischemia of the endolymphatic sac［J］.Acta Otolaryngol，1992，112（Stockh）：658.

7 Taizo T.Endolymphatic hydrops induced by chronic administration of vasopressin［J］.Hearing research，2000，140：1.

8 Kumagami H，Loewenheim H，Beitz E，et al.The effect of anti－diuretic hormone on the endolymphatic sac of the inner ear［J］.Pflugers Arch－Eur J Physiol，1998，436：970.

9 蔣子棟，張連山.醛固酮誘發豚鼠雙耳膜迷路積水［J］.中國醫學科學院學報，2002，24：501.

10 Lohuid Peter JFM，Klis Sjaak FL，Klop Martin C，et al.Signs of endolymphatic hydrops after perilymphatic perfusion of the guinea pig cochlea with cholera toxin：A pharmacological model of acute endolymphatic hydrops［J］.Hear Res，1999，137：103.

11 Feldman AM，Brusilow SW.Effects of cholera toxin on cochlear endolymph production：Model for endolymphatic hydrops［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1976，73：1 761.

12 Dunnebier EA，Segenhout JM，Wit HP，et al.Two－phase endolymphatic hydrops：A new dynamic guinea pig model［J］.Acta Otolaryngol（Stockh），1997，117：13.

13 Tomiyama S.Development of endolymphatic hydrops following immune response in the endolymphatic sac of the guinea pig［J］.Acta otolaryngol，1992，112：470.

14 Sawada I，KiTahara M，Kitajima K，et al.Induction of experimental endolymphatic hydrops by immunologic techniques［J］.Am J Otol，1987，8：330.

15 譚長強，鐘啟明，曹銀成.內淋巴囊同種抗原免疫致自身免疫性Meniere病的實驗研究［J］.耳鼻咽喉—頭頸外科，1997，4：47.

16 翟所強，鄒靜，姜泗長，等.同種內耳抗原免疫豚鼠致感音神經性聾的實驗研究［J］.軍事進修學院學報，1994，15：251.

17 王紅生，趙沛英，李志光，等.補體活化與膜迷路積水［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，1994，29：371.

18 Van Benthem PPG，Klis SFL，Alberts FWJ，et al.Nimodipine and experimental endolymphatic hydrops.In：Filipo R，Barbara M（eds）.Meniere＇s disease：Perspective in the 90＇s［M］.Amsterdam，New York：Kugler Publ，1994.183～189.

19 Valk WL，Wit HP，Albers FWJ.Changes in distortion of two－tone cochlear microphonic and otoacoustic emission signals during an acute endolymphatic hydrops in the guinea pig［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2006，263：430.

20 Flock A，Flock B.Hydrops in the cochlea can be induced by sound as well as by static pressure［J］.Hear Res，2000，150：175.

21 Salt AN.Acute endolymphatic hydrops generated by exposure of the ear to nontraumatic low－frequency tones［J］.JARO，2004，5：203.

22 Fukuda S，Keithley EM，Harris JP.The development of endolymphatic hydrops following CMV inoculation of the endolymphatic sac［J］.Laryngoscope，1988，98：439.

23 Sperling NM，Paparella MM，Yoon Th，et al.Symptomatic versus asymptomatic endoulymphatic hydrops：A histopathologic comparison［J］.Laryngoscope，1993，103：277.

（2010－05－20收稿）

（本文編輯 李翠娥）

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.025

R764.34

A

1006－7299（2011）01－0078－03

劉陽（Email：liuyangdoc＠sina.com）mi［8］報道采用血管加壓素豚鼠腹腔注射后2小時即能誘導出急性內淋巴積水成功率為40%，積水程度為輕中度；皮下隔日注射共60天能制作出慢性內淋巴積水模型，成功率為70%。Taizo［7］采用血管加壓素皮下微泵埋植1周也誘導出了豚鼠內淋巴積水模型，成功率為100%。蔣子棟［9］通過連續5天腹腔注射醛固酮誘導出豚鼠內淋巴積水，成功率為100%，并報道1個月后誘導出的內淋巴積水為輕度，2個月后則為中重度。