腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞在受損耳蝸內(nèi)的生存和分化△

劉謙虛 賀湘波 陳觀貴，3 謝鼎華 譚志強

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞在受損耳蝸內(nèi)的生存和分化△

劉謙虛1，2賀湘波1陳觀貴1，3謝鼎華1譚志強1

目的 探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor gene，BDNF）基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞（bone－marrow mesenchymal stem cells，BMSC）在受損耳蝸內(nèi)的生存和分化情況。方法 將轉(zhuǎn)染了BDNF基因并在體外誘導(dǎo)分化的BMSC（BDNF－BMSC）標(biāo)記后，通過鼓階注射植入阿米卡星致聾的豚鼠耳蝸內(nèi)（BDNF－BMSC組，18只），并設(shè)注射未誘導(dǎo)分化的BMSC的豚鼠為對照組（BMSC組，18只）。在注射后1、2、4 w取耳蝸組織石蠟切片，HE染色和熒光染色觀察注射細胞的分布；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron－specificenolase，NSE）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acid protien，GFAP）抗體免疫組化染色觀察注射細胞在耳蝸內(nèi)的分化。結(jié)果 BDNF－BMSC和BMSC在耳蝸內(nèi)均能成活并分布到一定的區(qū)域，鼓階和前庭階較多，中階和蝸軸較少。NSE和GFAP免疫化學(xué)可見BDNF－BMSC部分細胞陽性染色，而BMSC陽性細胞較少。BDNF－BMSC在1、2 w時平均光密度（AOD）值較高，在4 w時顯著下降（P＜0.05）；在各時間點，BDNF－BMSC組AOD值均顯著高于BMSC組（P＜0.01）。結(jié)論 誘導(dǎo)分化前后的BMSC耳蝸移植后均能成活并分布到一定的區(qū)域，在耳蝸內(nèi)BDNF－BMSC分化能力明顯強于BMSC，但隨時間延長分化能力下降。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因； 骨髓間充質(zhì)干細胞； 耳蝸

Okano等［1］首次報道應(yīng)用NIH3T3細胞作為載體的內(nèi)耳基因治療以來，目前國內(nèi)外還沒有基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞（bone－marrow mesenchymal stem cells，BMSC）移植損傷內(nèi)耳的報道。本實驗將在體外轉(zhuǎn)染了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）基因后誘導(dǎo)分化成神經(jīng)樣細胞的BMSC（BDNF－BMSC）［2］移植入阿米卡星致聾的豚鼠耳蝸內(nèi)，并與移植未分化的BMSC對比，研究其在耳蝸內(nèi)的成活、分布和分化情況，為進一步探討它對內(nèi)耳的保護功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 體重250～350 g的純白紅目短毛豚鼠（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動物實驗室提供），雌雄不限，對聲反應(yīng)靈敏。阿米卡星450 mg· kg－1·d－1皮下注射14天后行ABR測試。選擇ABR反應(yīng)閾大于75 d B SPL的36只豚鼠隨機分為2組，每組18只：一組鼓階內(nèi)泵入BMSC（BMSC組），另一組泵入BDNF－BMSC（BDNF－BMSC組）。各組豚鼠在耳蝸注射后1、2、4 w處死，每個時間點6只。耳蝸注射前、后3 d肌肉注射氯霉素30 mg·kg－1·d－1，以防感染。

1.2 主要試劑和儀器 BDNF－BMSC（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院中心實驗室培養(yǎng)），兔抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron－specificenolase，NSE）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acid protien，GFAP）多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB試劑盒（均為武漢博士德公司產(chǎn)品），手術(shù)顯微鏡、熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），微量注射器（日本Narishige公司），Image Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)（美國MediaCybernetics公司）。

1.3 BDNF－BMSC和BMSC的標(biāo)記 選取生長良好的BDNF－BMSC和BMSC，吸干培養(yǎng)基，加入4，6－聯(lián)脒－2－苯基吲哚溶液，避光孵育60 min，Hank’s液沖洗，消化，離心，DMEM培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整至2 ×104個／μl，37℃培養(yǎng)箱中備用（不超過1小時）。

1.4 內(nèi)耳細胞移植 豚鼠麻醉后取耳后切口，分離肌肉，暴露聽泡。微細金剛鉆在聽泡骨壁削磨直徑約2 mm小孔，距圓窗龕約1 mm耳蝸底回鼓階外側(cè)壁下方，磨直徑約1 mm小孔。安置好微量注射器，鼓階內(nèi)分組泵入下列液體各10μl：BMSC組泵入未分化的BMSC；BDNF－BMSC組泵入在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細胞的BDNF－BMSC。嚴(yán)格控制導(dǎo)入速度，保持在5 min以上緩慢注入。注射完畢后取肌漿封堵造孔，玻璃離子粘固粉封閉聽泡骨質(zhì)開口，縫合切口。

1.5 內(nèi)耳標(biāo)本處理 耳內(nèi)細胞移植后1、2、4 w，選擇無明顯眩暈、行動靈活的豚鼠，麻醉后暴露胸腔，游離心臟，4%多聚甲醛心內(nèi)灌注。快速斷頭，取出并開放聽泡，固定液中過夜。次日將標(biāo)本脫鈣，連續(xù)10 d。梯度酒精、二甲苯脫水，平行蝸軸方向石臘包埋，Rosenthal小管完整處平行中軸切片，厚約5 μm，每隔4張取1張，盡可能取靠近蝸軸中央的切片。烤箱中放置2～3小時。

1.6 病理組織學(xué)觀察 耳蝸標(biāo)本行蘇木素－伊紅（HE）染色，觀察耳蝸組織結(jié)構(gòu)，重點觀察移植細胞數(shù)量、分布等。

1.7 耳蝸組織熒光檢測 耳蝸組織玻片上滴加DAKO熒光防淬液，蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下420μm左右的藍色波長進行激發(fā)，藍色圓點為BDNF－BMSC或BMSC胞核。

1.8 免疫組織化學(xué)和AOD分析 用SABC法：脫蠟、水化；3%H2O2封閉，滅活內(nèi)源性酶；抗原微波熱修復(fù)；山羊血清封閉液封閉；滴加一抗（NSE、GFAP抗體），4℃過夜；次日復(fù)溫，加二抗；滴加試劑SABC；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片。顯微鏡觀察染色情況，重點觀察移植細胞。高倍鏡（200倍）下Image Pro Plus6.0系統(tǒng)計算移植細胞的平均光密度（average optical density，AOD）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用非配對資料t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本選擇 耳蝸移植后至處死前，兩組2 w、BDNT－BMSC組4 w各有一只豚鼠有眩暈癥狀，疑有迷路炎，不作為下一步實驗動物。切片觀察時蝸內(nèi)結(jié)構(gòu)欠清晰、有較多炎性細胞和滲出物的標(biāo)本（疑有迷路炎）不作為統(tǒng)計對象。每組各時間點選取切片清晰的4只豚鼠作為觀察對象。

2.2 耳蝸切片病理組織學(xué)觀察 移植后可見移植成活細胞相互交織呈網(wǎng)片狀，有的聚集成團，有的分散成個，大部分細胞有貼壁或貼膜生長，周圍有血細胞（圖1）。所有圖片均取自蝸內(nèi)注射2 w后標(biāo)本。

2.3 耳蝸標(biāo)本熒光觀察 兩組標(biāo)本均可見藍色熒光信號，多呈橢圓形、圓形或近圓形，少數(shù)不規(guī)則，鼓階為多（圖2a，），前庭階其次，中階少（圖2b），蝸軸中僅有很少的熒光散在分布（圖2a），螺旋韌帶未見熒光。細胞多貼近骨壁或膜性結(jié)構(gòu)，呈片狀、簇狀聚集，也有散在分布的，周圍可見無熒光的血細胞。1和2 w時熒光信號較多，4 w時熒光下降。

2.4 蝸內(nèi)移植細胞免疫化學(xué)結(jié)果 NSE染色后著色細胞胞漿呈棕黃色，形態(tài)不一，為多邊形、紡錘形或卵圓形等。BMSC組僅有少部分移植細胞染色陽性（圖3、4），BDNF－BMSC組GFAP染色陽性細胞數(shù)較BMSC組多（圖5、6）。

圖1 BMSC組耳蝸內(nèi)注射2 w后耳蝸內(nèi)移植細胞 移植細胞呈網(wǎng)片狀，聚集成團或分散成個，有貼壁或貼膜生長趨勢（箭頭所示），周圍有血細胞（HE×100）圖2 BMSC組蝸內(nèi)注射2 w后耳蝸細胞移植熒光觀察 藍色熒光信號鼓階內(nèi)較多（2a，紅箭頭所示），中階少（2b，紅箭頭所示），蝸軸內(nèi)很少（2a，白箭頭所示）（DAPI×200）

圖3 BMSC組NSE染色 少部分細胞染色陽性（箭頭所示）（SABC法×200）圖4 BMSC組GFAP染色 少部分細胞染色陽性（箭頭所示）（SABC法×200）圖5 BDNF－BMSC組NSE染色 陽性細胞數(shù)較BMSC組多（箭頭所示）（SABC法×200）圖6 BDNF－BMSC組GFAP染色 陽性細胞數(shù)較BMSC組多（箭頭所示）（SABC法×200）

免疫組織化學(xué)結(jié)果經(jīng)Image Pro Plus6.0分析系統(tǒng)分析，AOD值比較如表1。可見，兩種抗體染色的各時間點，BDNF－BMSC組AOD均高于BMSC組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；兩組4 w時AOD值均低于同組1、2 w時（P＜0.05），組內(nèi)1 w與2 w時比較AOD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組耳蝸細胞移植后不同時間NSE、GFAP染色平均光密度（%，ˉx±s）

3 討論

氨基糖苷類抗生素（aminoglycoside antibiotics，Am An）導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾的機理主要是內(nèi)耳毛細胞損傷后分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factors，NTF）減少，繼發(fā)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（spiral ganglion neurons，SGN）凋亡。外源性NTF可延緩Am An引發(fā)的SGN退化［3］，但它們作為蛋白質(zhì)類物質(zhì)不易通過血內(nèi)耳屏障，且半衰期短，在蝸內(nèi)的作用時間短。為更有效地把NTF導(dǎo)入內(nèi)耳并長期穩(wěn)定表達，人們探討利用載體將NTF基因植入耳蝸。BMSC具有干細胞特性［4］，可廣泛遷移，能分泌BDNF等細胞因子，可作為理想的基因載體。將轉(zhuǎn)染了BDNF基因的BMSC植入內(nèi)耳，BDNF可營養(yǎng)細胞而促進組織恢復(fù)，還能誘導(dǎo)BMSC分化；BMSC能分化為神經(jīng)樣細胞，又能分泌BDNF等NTF，兩者為內(nèi)耳提供了更好的保護作用。有一些學(xué)者用BDNF和BMSC聯(lián)合治療腦［5］、脊髓［6］等組織損傷，取得了比單獨應(yīng)用BDNF或BMSC更好的效果。但目前國內(nèi)外還沒有BDNF基因修飾BMSC移植損傷內(nèi)耳的報道。

Ito等［7］最初使用干細胞進行內(nèi)耳移植，證明神經(jīng)干細胞能在新生大鼠耳蝸內(nèi)存活超過4 w，Hildebrand等［8］發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞在慶大霉素致聾的豚鼠耳蝸內(nèi)能存活至少3 w，Wang等［9］則觀察到BMSC可在活體內(nèi)成活3 m。本實驗觀察到BDNF－BMSC和BMSC在蝸內(nèi)至少能存活4 w，細胞數(shù)在移植后1 w和2 w時較多，4 w時下降。分析其原因可能為：受Am An損傷的耳蝸自身分泌NTF增多，并可增強移植細胞分泌NTF的能力，從而有利于細胞的生存，使移植細胞能不在短期內(nèi)死亡，因此1 w和2 w時觀察到的細胞數(shù)相當(dāng)。隨著時間的推移，耳蝸和移植細胞分泌能力下降，蝸內(nèi)NTF減少，移植細胞逐漸死亡，因此4 w時觀察到的細胞數(shù)較1、2 w時減少。

Sharif等［10］通過鼓階注射BMSC，發(fā)現(xiàn)移植細胞主要分布在鼓階，還能遷移到螺旋韌帶、Corti器、聽神經(jīng)等部位。Hu等［11］用神經(jīng)干細胞通過鼓階移植到耳聾豚鼠耳蝸內(nèi)，觀察到移植細胞沿著聽神經(jīng)分布并接近感覺上皮區(qū)。Matsuoka等［12］將BMSC通過鼓階和蝸軸注入正常或毒毛旋花子甙－g損傷的豚鼠耳蝸內(nèi)，結(jié)果蝸軸注射組的軸內(nèi)BMSC密度高于三個階，鼓階注射組的蝸軸中則未見BMSC。本實驗通過鼓階注射后在三個階中均見細胞存活，鼓階、前庭階較多，中階少，蝸軸中僅見少量移植細胞。分析外淋巴腔和蝸軸的解剖屏障可能對BMSC的遷延起一定的阻隔作用。不過為了移植細胞能更多的到達SGN附近，蝸軸注射可能是較理想的方式。

Naito等［13］證實BMSC能在內(nèi)耳轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，但比率很低，表達神經(jīng)微絲蛋白和GFAP分別為0.4%和1.2%。為了提高移植細胞向神經(jīng)樣細胞分化的效率，可在體外先將其誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細胞［14］。NSE、GFAP分別是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞的特異性標(biāo)志物，本實驗通過NSE、GFAP染色顯示，在蝸內(nèi)，BDNF－BMSC向神經(jīng)樣細胞分化的能力明顯強于BMSC，這與體外研究的結(jié)果相似［2］。

本實驗對BMSC和BDNF－BMSC內(nèi)耳移植后的生存和分化進行了初步研究，為進一步探討移植細胞對損傷內(nèi)耳的保護提供了基礎(chǔ)。需要進一步解決的問題主要有：①怎樣使移植細胞更有效地到達并整合到靶位置；②如何延長移植細胞的存活時間。隨著這些問題的解決，細胞移植、基因治療有望成為人們治療感音神經(jīng)性聾的新途徑。

1 Okano T，Nakagawa T，Kita T，et al.Cell－gene delivery of brain－derived neurotrophic factor to the mouse inner ear［J］.Mol Ther，2006，14：866.

2 劉謙虛，謝鼎華，陳觀貴.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細胞初步觀察［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2009，17：252.

3 Shepherd RK，Coco A，Epp SB.Neurotrophins and electrical stimulation for protection and repair of spiral ganglion neurons following sensorineural hearing loss［J］.Hear Res，2008，242：100.

4 Kronenwett R，Haas R.Differentiation potential of stem cells from bone marrow［J］.Med Klin（Munich），2006，101（Suppl 1）：182.

5 Mahmood A，Lu D，Wang L，et al.Intracerebral transplantation of marrow stromal cells cultured with neurotrophic factors promotes functional recovery in adult rats subjected to yraumatic brain injury［J］.Journal of Neurotrauma，2002，19：1 609.

6 康德智，王燈亮，林建華，等.骨髓間質(zhì)干細胞和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用促進兔脊髓外傷性截癱的修復(fù)［J］.中國臨床解剖學(xué)雜志，2007，25：60.

7 Ito J，Kojima K，Kawaguchi S.Survival of neural stem cells in the cochlea［J］.Acta Otolaryngol，2001，121：140.

8 Hildebrand MS，Dahl HH，Hardman J，et al.Survival of partially differentiated mouse embryonic stem cells in the scala media of the guinea pig cochlea［J］.Assoc Res Otolaryngol，2005，6：341.

9 Wang JS，Shum TD，Galipeau J，et al.Marrow mesenchymal stem cells for cellular cardiomyoplasty：feasibility and potential clinical advantages［J］.Thorac Cardiovasc Surg，2000，120：999.

10 Sharif S，Nakagawa T，Ohno T，et al.The potential use of bone marrow stromal cells for cochlear cell therapy［J］.Neuroreport，2007，18：351.

11 Hu Z，Wei D，Johansson CB，et al.Survival and neural differentiation of adult neural stem cells transplanted into the mature inner ear［J］.Exp Cell Res，2005，302：40.

12 Matsuoka AJ，Kondo T，Miyamoto RT，et al.Enhanced survival of bone marrow－derived pluripotent stem cells in an animal model of auditory neuropathy［J］.Laryngoscope，2007，117：1 629.

13 Naito Y，Nakamura T，Nakagawa T，et al.Transplantation of bone marrow stromal cells into the cochlea of chinchillas［J］.Neuroreport，2004，15：1.

14 Hildebrand MS，Dahl HH，Hardman J，et al.Survival of partially differentiated mouse embryonic stem cells in the scala media of the guinea pig cochlea［J］.Assoc Res Otolaryngol，2005，6：341.

（2010－03－15收稿）

（本文編輯 李翠娥）

A PreIiminary Study of Brain－Derived Neurotrophic Factor Gene Transfected Bone－Marrow MesenchymaI Stem CeIIs TranspIartafion Damaged CochIea

Liu Qianxu*，He Xiangbo，Cheng Guangui，Xie Dinghua，Tan Zhiqiang
（*Hearing Research Institute，Department of OtoIaryngoIogy and Head＆Neck Surgery of the Second Xiangya HospitaI，CentraI South University，Changsha，410011，China）

Objective To investigate the survivorship and differentiation of bone－marrow mesenchymal stem cells（BMSC）cochlea transfected by human brain－derived neurotrophic factor（BDNF）gene in damaged.Methods BMSC were inducted and marked after transfected by h BDNF gene in vitro.These BMSC（BDNF－BMSC）were transplanted into tympanic scala of the guinea pigs which were deafened by amikacin（AK）.While in the control group uninducted BMSC were injected into the cochlea.The cochlea were obtained on 1，2 and 4 after injection and paraffin－embedded sections were new weeks.The distribution of BDNF－BMSC and BMSC was observed by HE and fluor staining，the differentiation of these cells was detected with immunohistochemistry of neuron－specificenolase（NSE）and glial fibrillary acid protien（GFAP）antibody.ResuIts BDNF－BMSC and BMSC survived and scattered over some areas in the cochlea.There were some transplanted cells in scala tympani and scala vestibuli，only few in scala media and modiolus.Some BDNF－BMSC were positive for NSE and GFAP，while only a few BMSC were positive for NSE and GFDP.Immunochemistry staming analyzed with average optical density（AOD）showed：the AOD of the BDNF－BMSC group was high at 1 w and 2 w but significantly reduced on 4 w（P＜0.05），and was significantly higher than those in the BMSC group at any time points（P＜0.01）.ConcIusion Differentiated or un－differectiated BMSC survived and scattered over some areas when they were transplanted into cochlea.The differectiation ability of BDNF－BMSC was more obvions that of BMSC in cochlea，but reduced with time.

Brain－derived neurotrophic factor gene； Bone－marrow mesenchymal stem cells； Cochlea

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.016

R764.35

A

1006－7299（2011）01－0052－04

△ “湖南省十一五期間貧困殘疾兒童人工耳蝸植入援助計劃”專項資助課題

1 中南大學(xué)耳科研究所、湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（長沙 410011）； 2 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院（珠海市人民醫(yī)院）耳鼻咽喉頭頸外科； 3 廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科

劉謙虛，男，江西人，博士，主治醫(yī)師，主要從事聽力與耳聾的基礎(chǔ)和臨床研究。

謝鼎華（Email：huaxie＠2118.cn）