老年性聾大鼠聽皮層病理變化*

陳十燕 梁永輝 羅萍 陳賢明

·實驗研究·

老年性聾大鼠聽皮層病理變化*

陳十燕1梁永輝1羅萍1陳賢明1

目的 探討老年性聾大鼠聽皮層病理變化。方法 通過甲苯胺藍染色和免疫組化技術檢測并比較正常成年大鼠（對照組，20只）、正常聽力老年大鼠（18月齡）（老年組，20只）及以D－半乳糖建造的老年性聾大鼠（實驗組，20只）聽皮層神經元的形態、數量和興奮性神經遞質乙酰膽堿（Ach）、谷氨酸（Glu）及抑制神經遞質γ－氨基丁酸（GABA）的陽性表達數量。結果 實驗組大鼠較老年組和對照組大鼠聽皮層神經元數量減少（P＜0.05），而老年組大鼠與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗組大鼠較老年組和對照組的ACh、GABA表達下調（P＜0.01），Glu的表達上調（P＜0.01）。結論 聽皮層神經元的減少、神經遞質Ach、GABA表達下調和Glu表達上調為老年性聾聽皮層病理表現，可能與老年性聾的發病有關。

老年性聾； 聽皮層； 神經元； 神經遞質；

近年來，老年性聾的研究主要集中在耳蝸和螺旋神經節，但老年性聾患者普遍存在的言語分辨率和認知能力下降的現象用外周病變很難解釋。本實驗擬通過檢測老年性聾大鼠聽皮層的病理變化，進一步探討其發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取耳廓反應靈敏、健康成年Wistar大鼠（購于上海實驗動物中心）40只，鼠齡2個月，體重150～180 g，雌雄不拘，隨機分為實驗組和對照組，每組20只。另選取正常聽力老年Wistar大鼠（購于鄭州大學實驗動物中心）20只為老年組，鼠齡18月，體重450～500 g，雌雄不拘。動物均無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，均無中耳炎。甲苯胺藍購于Amresco公司；D－半乳糖購于Sanland公司；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；膽堿乙酰轉移酶（cholineacetytransferase，Ch AT）、谷氨酸（Glu）、γ－氨基丁酸（GABA）多克隆抗體購于武漢博士德生物工程公司；二步法試劑盒購于福州邁新公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 實驗組動物腹腔注射D－半乳糖500 mg·kg－1·d－1連續10周，制作老年性聾動物模型，對照組動物腹腔注射同等量的生理鹽水，連續10周［1，2］。

1.2.2 ABR檢測 對照組和實驗組大鼠分別于建模10周后測ABR，老年組大鼠購回即行ABR測試，選取聽力正常大鼠。采用美國智聽公司（intelligent hearing system）Smart EP進行聽性腦干反應（ABR）檢測。三組動物均分別以1%戊巴比妥鈉按40 mg／kg行腹腔注射麻醉，隔聲室內（環境溫度25 ±3℃）完成測試。耳塞置于外耳道內，用針灸銀針作電極分別置入顱頂及雙側乳突皮下深達骨膜，顱頂為記錄電極，參考電極在測試耳乳突部，對側耳乳突部為接地電極。刺激聲為時程100 s的方波脈沖短聲（click），帶通濾波100～3 000 Hz，掃描時程10 ms，掃描平均疊加1 024次，增益10 000倍，短聲刺激重復率為11次／秒，刺激強度從90 dB SPL開始，5 dB一檔次遞減，以波Ⅲ確定閾值，再以80 dB SPL的刺激強度測試大鼠的各波潛伏期和波間期。取每只大鼠右耳結果進行分析。

1.2.3 血清MDA和SOD檢測 三組動物分別采靜脈血2 ml，室溫下靜置30 min，于4℃下3 500 r／min離心10 min，取上層血清置－20℃冰箱內儲存備測，測試的過程嚴格按照測試盒上的說明進行操作。分別計算出SOD活性和MDA的濃度。

1.2.4 聽皮層石蠟切片 動物以1%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）腹腔注射麻醉后開胸，經左心室快速灌注生理鹽水200～300 ml同時剪開右心耳沖凈血液，并先快速灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液100 ml左右，再緩慢的灌注400 ml，然后斷頭取腦入上述灌注液中，4℃下保存。次日修剪標本，取大腦聽皮層［聽皮層定位參照大鼠腦立體定位圖譜，聽皮層位于前囟（Bregma）后3.14～6.03 mm、下3.10～6.38 mm的范圍內］，橫切面從頭側向尾側，常規石蠟切片，片厚6 μm，每個蠟塊取10張切片，每張切片之間間隔20 μm，并從中隨機抽取5張切片，共五套。分別進行甲苯胺藍染色、Glu免疫組化染色、GABA免疫組化染色、CHAT免疫組化染色和陰性對照，部分備用。

1.2.5 免疫組化染色（采用二步法。） 常規的脫蠟、水化組織切片、修復抗原后，用3%H2O2去離子水孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶。然后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，2分鐘3次。分別加入兔抗大鼠Ch AT、Glu、GABA多克隆抗體（1：50，武漢博士德生物工程有限公司）4℃下孵育過夜。PBS沖洗，2分鐘3次。滴加二步法試劑盒中的試劑1，37℃下孵育20分鐘，用PBS沖洗2分鐘3次后，再滴加試劑2，37℃下孵育20分鐘，PBS沖洗2分鐘3次。然后用二氨基聯苯胺（DAB）顯色，并在顯微鏡下控制顯色，以特異性顯色最強，而背景基本不著色為準。自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。陰性對照用0.01 M PBS代替一抗，反應步驟相同。1.3 結果判定

1.3.1 聽皮層神經元計數 在400倍顯微鏡（OLYMPUS，日本）下，通過PIPS－2011病理圖文分析系統將圖像顯示于監視器上，從監視器上對神經元計數。每幅圖像顯示的實際范圍為0.079～0.103 mm。每一組隨機選取10張切片，每張切片選5個不同的視野進行計數，取每張切片的平均值。1.3.2 聽皮層中Ch AT、Glu、GABA多克隆抗體陽性反應的神經元計數 免疫陽性反應的神經元胞漿及胞核中出現棕黃至棕黑色顆粒，鏡下觀察時每例標本以核中出現棕黃至棕黑色顆粒為準。在400倍顯微鏡（OLYMPUS日本）下，通過PIPS－2011病理圖文分析系統將圖像顯示于監視器上，從監視器上對神經元計數。每幅圖像顯示的實際范圍為0.079～0.103 mm，每一組隨機選取10張切片，每張切片選5個不同的視野進行計數，取每張切片的平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件對資料進行數據分析，三組之間進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組ABR檢測結果 老年組和實驗組ABR反應閾、波I、Ⅲ潛伏期和I－Ⅲ波間期較對照組均有不同程度升高和延長，但老年組和對照組間差異無統計學意義（P＞0.05），實驗組不僅ABR反應閾明顯升高，且波I、Ⅲ潛伏期和波間期較老年組、對照組顯著延長，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 各組ABR反應閾、波潛伏期、波間期比較（xˉ±s，n＝20）

2.2 各組血清SOD活性和MDA濃度 實驗組和老年組SOD活性較對照組均有不同程度下降（P＜ 0.05），其中實驗組和老年組之間差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組SOD活性最低。實驗組和老年組MDA濃度較對照組均有不同程度升高（P＜0.05），其中實驗組MDA最高，較老年組差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 各組聽皮層神經元數 光鏡下見對照組和老年組聽皮層神經細胞密集，染色均勻，尼氏體正常，胞核和胞漿極少有皺縮和空泡樣變，膠質細胞正常。實驗組大鼠聽皮層神經元明顯減少，神經細胞腫脹，胞核和胞漿濃縮，尼氏體減少。實驗組聽皮層神經元數與對照組、老年組比較差異有顯著統計學意義，而對照組和老年組之間差異無統計學意義（P＞0.05）（表2，圖1）。

表2 各組SOD活性和MDA的濃度及聽皮層神經元個數比較（ˉx±s）（n＝20）

圖1 各組聽皮層甲苯胺藍染色結果（×400） a為對照組，b為老年組，c為實驗組圖2 各組聽皮層Ch AT表達（×400） a為對照組，b為老年組，c為實驗組圖3 各組聽皮層GABA表達（×400） a為對照組，b為老年組，c為實驗組圖4 各組聽皮層Glu表達（×400） a為對照組，b為老年組，c為實驗組

2.4 各組聽皮層神經元中Glu、GABA、Ch AT表達 光鏡下Glu、GABA、Ch AT免疫反應物呈棕黃色，位于細胞表面或胞漿中，神經元內亦見陽性沉積物。實驗組聽皮層中Glu陽性反應細胞個數明顯增多，與對照組、老年組比較差異有顯著統計學意義（P＜0.01），而對照組和老年組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗組聽皮層中GABA和Ch AT陽性反應細胞個數明顯減少，與對照組、老年組比較差異有顯著統計學意義，而對照組和老年組之間差異無統計學意義（P＞0.05）（表3，圖2～4）。

表3 各組陽性反應細胞個數（個，ˉx±s）（n＝20）

3 討論

老年性聾患者不僅表現為聽力下降，還表現為對聲音頻率、強度、時間及空間處理能力的下降，以及不同程度言語認知能力的下降［3］。而聽皮層則對復雜聲音信息的精確分辨、處理和加工起著關鍵作用［4］。本研究結果顯示實驗組大鼠血清中SOD活性降低和MDA的含量增高，且ABR反應閾明顯升高，波I、Ⅲ潛伏期和I－Ⅲ波間期較對照組明顯延長，說明老年性聾動物模型［5］造模成功。有學者通過比較3月齡成年大鼠和36月齡老年大鼠的聽皮層厚度，發現老年大鼠較成年大鼠減少46%左右，且神經元胞體與樹突的形態和結構均有改變［6］。此外，還有研究發現老年性聾Wistar大鼠較3月齡Wistar大鼠的聽皮層細胞凋亡率顯著升高，而導致聽皮層神經元數量減少，造成聽皮層的功能減退［7］。文中結果可見，實驗組大鼠聽皮層神經元計數明顯少于對照組和老年組，并且其形態上也發生顯著改變，與上述文獻報道一致。

乙酰膽堿是哺乳動物中樞神經系統的一種主要神經遞質，且分布廣泛。Ch AT在突觸小泡外催化膽堿和乙酰輔酶A生成乙酰膽堿（Ach）和輔酶A，因此Ch AT是Ach的一種特異性標志，Ch AT的分布和Ach是一致的。Raza（1994）觀察老年大鼠耳蝸核、外側丘系和下丘核中Ch AT的活性發現，老年大鼠上述部位中Ch AT的活性較幼年大鼠下降56%，較成年大鼠下降23%。楊衛平等［8］利用免疫組織化學技術檢測成年大鼠和老年大鼠耳蝸核中Ch AT的含量，證實老年大鼠耳蝸核內的Ch AT陽性細胞和陽性纖維數顯著少于正常成年大鼠（P＜0.01），老年大鼠耳蝸核Ach受體功能也下降。本結果顯示，實驗組聽皮層Ch AT含量較老年組和對照組顯著降低，而老年組和對照組之間其含量差異也有顯著統計學意義（P＜0.05）。由于老化增齡性基因調節失調而引起相應的神經遞質合成酶和神經遞質的量的減少，結合老年性聾患者對聲音傳導、加工整合能力下降和ABR閾值升高的現象，推測聽皮層中乙酰膽堿含量的變化在老年性聾的發生機制中可能起一定作用。

目前谷氨酸已經是公認的自聽神經末梢傳入至耳蝸核神經細胞的興奮性神經遞質。有研究對聽皮層中四種氨基酸類神經遞質（GABA、Gly、Glu、Asp）進行測定，發現谷氨酸在聽皮層中含量最高［9］。Pujol等［10］認為谷氨酸是快反應興奮性的傳入神經遞質，此外，它還有興奮性毒性的特點，過量的谷氨酸持續與興奮性谷氨酸受體結合可引起神經元受損乃至死亡，這與二者持續結合引起膜內外某些離子（如Cl－和Ca2＋等）的分布失衡、線粒體不可逆損傷等有關。一些與年齡有關的耳蝸損害，特別是初級傳入纖維和I型螺旋神經元的喪失，可能是由谷氨酸興奮性毒性所致［11］。本實驗發現實驗組大鼠聽皮層中谷氨酸含量較老年組和對照組顯著增高，而老年組和對照組之間的無顯著差異。推測是由于過量的谷氨酸在突觸后膜上聚集，繼而發生上述一系列病理變化，引起聽覺神經元功能障礙和聽力下降。因此，谷氨酸含量過高可能是老年人神經細胞退變的一個重要因素。

GABA含量的變化過程反映了神經元的功能狀態，GABA抑制性減弱可能是造成聽覺分辨率降低的原因［12］。在老年性聾聽覺中樞神經遞質GABA的研究中，國內外主要集中在耳蝸核和下丘等處，Caspary等（1995）研究發現，與正常成年大鼠相比，老年性聾大鼠下丘釋放GABA的能力、下丘中神經遞質GABA的含量、免疫反應GABA陽性神經元數量以及GABA與其受體結合的能力均有明顯下降和減退。Burianova等［13，14］研究發現GABA的合成酶GAD65和GAD67在老年性聾動物模型F344大鼠聽覺中樞中的含量較正常F344大鼠顯著下降。本研究實驗組大鼠聽皮層GABA陽性神經細胞數少于對照組和老年組，且細胞染色較淺，而老年組與對照組之間無明顯差異，說明實驗組大鼠聽皮層GABA含量減少，其聽力減退與其聽覺中樞退行性變化趨勢一致。Ling等［15］通過原位雜交和免疫組化等方法觀察青年大鼠、中年大鼠和正常聽力老年大鼠聽皮層中GABA合成酶的含量變化，其實驗結果與本研究相似。這些研究結果結合老年人言語辨別率降低，對噪聲刺激的抑制作用減弱，在嘈雜環境中聽力下降的現象，可以推測出GABA在聽皮層的含量與老年性聾的發病具有一定的相關性，可能是由于GABA的含量減少引起聽覺系統中遞質平衡紊亂，抑制性神經沖動減弱，興奮性神經沖動占優勢，從而使聽覺系統對內源性噪聲的抑制作用減弱，使言語辨別率和聽力降低。

綜上所述，老年性聾的發生可能是多種因素綜合作用的結果，聽皮層中神經元數量的減少以及興奮性和抑制性神經遞質失衡可能是其發病機制之一。通過觀察老年性聾大鼠聽皮層神經元和神經遞質的變化，進一步探討老年性聾的發病機制，在臨床上可以應用改善聽皮層神經遞質失調的藥物，從而為老年性聾的預防和治療開辟新途徑。

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（2010－03－19收稿）

（本文編輯 周濤）

PathoIogicaI Changes in Auditory Cortex of Aged Rats with Presbycusis

Chen Shiyan，Liang Yonghui，Luo Ping，Chen Xianming
（Department of OtoIaryngoIogy－Head and Neck Surgery，Fuzhou GeneraI HospitaI of PLA，Fuzhou，350025，China）

Objective To study the pathological changes in auditory cortex of aged rat.Methods Toluidine blue staining and immunohistochemistry were used to detect and compare the morphous and number of neurons and the content of two kinds of excitatory neurotransmitter-acetylcholine（Ach）and glutamic acid（Glu）as well as one inhibitory neurotransmitter-γ－aminobutyric acid（GABA）in auditory cortex in normal adult rats，aged rats with normal hearing（18 months old）and model rats of presbycusis established by D－galactose.ResuIts 1.Comparing normal adult rats and aged rats with normal hearing，the number of neurons in auditory cortex of model rats of presbycusis were obviously reduced（P＜0.05）while there were no visible changes between normal adult rats and aged rats with normal hearing（P＞0.05）.Comparing normal adult rats and aged rats with normal hearing，the content of Ach and GABA in model rats of presbycusis were significantly increased（P＜0.01）while Glu significantly decreased（P＜0.01）.ConcIusion Presbycusis may be related to reduced neurons number，decreased Ach and GABA content and increased Glu content in auditory cortex.

Presbycusis； Auditory cortex； Nerve cell； Neurotransmitter

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.015

R764.43＋6

A

1006－7299（2011）01－0047－05

* 福建省科技計劃重點項目（2009Y0041）

1 南京軍區福州總醫院耳鼻咽喉－頭頸外科（福州 350025）

陳十燕，男，湖北人，碩士研究生，研究方向為耳聾的基礎和臨床研究。

陳賢明（fzchxming＠sina.com）