聽力復(fù)篩未通過的新生兒常見聾病易感基因篩查結(jié)果分析△

周佳霖 歷建強(qiáng) 羅仁忠 王大勇 溫瑞金 紀(jì)育斌 王秋菊

聽力復(fù)篩未通過的新生兒常見聾病易感基因篩查結(jié)果分析△

周佳霖1歷建強(qiáng)2羅仁忠1王大勇2溫瑞金1紀(jì)育斌2王秋菊2

目的 對聽力復(fù)篩未通過的新生兒進(jìn)行聾病易感基因篩查和聽力學(xué)評估，探討新生兒聽力聯(lián)合基因篩查的臨床意義。方法 對2007年5月至2007年12月復(fù)篩未通過轉(zhuǎn)診至廣州市兒童聽力診斷中心的200例新生兒，運用篩查型OAE、AABR、聲導(dǎo)抗、40 Hz－AERP等進(jìn)行聽力學(xué)評估和醫(yī)學(xué)診斷。對所有新生兒應(yīng)用遺傳疾病篩查采樣卡采集足跟血，進(jìn)行耳聾易感基因包括線粒體12Sr RNAm.A1555G、GJB2基因c.235delC、SLC26 A4基因c.919－2 A＞G聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)（PCR），Alw26I限制性內(nèi)切酶篩查線粒體12Sr RNAm.A1555G點突變，對酶切陽性病例進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序驗證；對GJB2基因編碼區(qū)和SLC26A4基因c.919－2A＞G突變位點所在區(qū)域進(jìn)行PCR產(chǎn)物的直接測序。DNAStar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。結(jié)果 200例未通過聽力復(fù)篩的新生兒中，190例聽力正常，最終確診10例聽力損失，其中，6例單耳聽力損失，4例雙耳聽力損失。基因檢測結(jié)果顯示：6例為GJB2基因c.235delC突變，占3%（6／200），其中，2例為GJB2基因c.235delC純合突變，占1%，4例為GJB2基因c.235delC雜合攜帶，占2%；1例為SLC26 A4基因c.919－2A＞G雜合攜帶，占0.5%（1／200）；未發(fā)現(xiàn)線粒體12Sr RNAm.A1555G點突變。這7例基因篩查結(jié)果異常者中，2例為雙耳重度聽力損失，5例雙耳聽力正常。結(jié)論

新生兒； 聽力篩查； 基因； 耳聲發(fā)射； 自動判別聽性腦干反應(yīng)

隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，耳聾的遺傳相關(guān)性逐漸被確立。目前，已有100多個耳聾相關(guān)基因被確立，其中30多個耳聾相關(guān)基因已經(jīng)被克隆。經(jīng)流行病學(xué)統(tǒng)計，線粒體12Sr RNAm.A1555G、GJB2基因c.235delC和SLC26A4基因c.919－2 A＞G被確定為中國人群中最常見耳聾基因突變位點［1］。因此，2007年我國開始試點實施新生兒聽力和耳聾易感基因聯(lián)合篩查［2］。本研究對廣州市200例聽力復(fù)篩未通過的新生兒進(jìn)行聽力和基因聯(lián)合篩查，探討新生兒聽力和聾病易感基因聯(lián)合篩查的意義及可行性。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2007年5月至2007年12月在廣州市出生且未通過聽力復(fù)篩而轉(zhuǎn)診至廣州市兒童醫(yī)院聽力診斷中心的200例新生兒為研究對象，其中男150例，女50例，男女比例為3：1。

1.2 方法

1.2.1 聽力篩查方法 新生兒在當(dāng)?shù)乇＝≡撼錾螅?天內(nèi)采用篩查型耳聲發(fā)射（OAE）進(jìn)行初篩，42天采用篩查型OAE或／和自動判別聽性腦干反應(yīng)（AABR）進(jìn)行復(fù)篩。初篩和復(fù)篩均未通過的嬰幼兒在3個月內(nèi)轉(zhuǎn)診到廣州市兒童醫(yī)院聽力診斷中心做聽力學(xué)評估。

1.2.2 聽力學(xué)評估方法 對所有轉(zhuǎn)診新生兒均行行為測聽、ABR、DPOAE、聲導(dǎo)抗、40 Hz－AERP等測試檢查，綜合評價和分析聽力情況。

1.2.3 耳聾易感基因的檢測 所有新生兒采用中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻喉科研究所自行設(shè)計的含有聽力篩查信息和血樣信息的新生兒遺傳疾病篩查采樣卡（實用型發(fā)明專利－200720103139.4）采集新生兒足跟血。自然晾干后密封保存，郵寄往國家人類基因組北方中心分子遺傳實驗室，直接用于線粒體12Sr RNA、GJB2基因、SLC26A4基因的聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)（polymerasechain reaction，PCR）。線粒體12Sr RNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)用Alw26I限制性內(nèi)切酶篩查線粒體12Sr RNAm.A1555G點突變，對酶切陽性病例進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序驗證；GJB2基因編碼區(qū)和SLC26A4基因c.919－2 A＞G突變位點所在區(qū)域的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的直接測序［2］。使用DNAStar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.2.4 隨訪 對所有轉(zhuǎn)診的嬰幼兒隨訪至少兩年，動態(tài)觀察小兒的聽力和語言發(fā)育情況。

2 結(jié)果

2.1 新生兒聽力學(xué)評估和醫(yī)學(xué)診斷結(jié)果 200例新生兒聽力評估結(jié)果見表1，190例雙耳聽力正常，最終確診10例聽力損失新生兒，其中，6例單耳聽力損失，4例雙耳聽力損失（其中2例為GJB基因c.235delC純合突變）。聽力損失分級按WHO－1997年聽力障礙分級標(biāo)準(zhǔn)［3］，單耳輕度聽力損失1例，重度聽力損失5例；雙耳輕度聽力損失2例，重度聽力損失2例。

2.2 新生兒基因篩查結(jié)果 200例新生兒中，mt12Sr RNAm.A1555G基因篩查均為陰性，未見致病突變；SLC26A4基因c.919－2A＞G突變篩查發(fā)現(xiàn)1例為雜合攜帶，占0.5%（1／200）；GJB2基因篩查發(fā)現(xiàn)6例新生兒的基因型為GJB2基因c.235delC，占3%（6／200），其中4例為GJB2基因c.235delC雜合突變，占2%，2例為GJB2基因c.235delC純合突變，占1%（表2）。這7例基因篩查結(jié)果異常者中，2例為雙耳重度聽力損失，其中病例6在隨訪中聽力結(jié)果好轉(zhuǎn)為中度。5例雙耳聽力正常。

表1 未通過聽力篩查新生兒聽力學(xué)評估結(jié)果（例）

表2 7例基因檢測結(jié)果陽性的聽力損失程度、出生及家族史情況

3 討論

目前，OAE與AABR的聯(lián)合聽力學(xué)檢測已被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)、有效、方便的篩查方式［4］。有資料顯示，OAE的靈敏性為99.51%，特異性約為68.65%［5］；ABR的敏感性多數(shù)報道為100%，特異性為94.0%～99.1%［6］，所以，在篩查過程中，假陰性和假陽性很難避免。2000年的形勢報告［7］中也指出ABR和OAE兩種技術(shù)都可以顯示假陰性結(jié)果，部分新生兒因為中耳腔內(nèi)羊水和胎脂的暫時性存留影響中耳功能而使聽力篩查不能通過，隨著羊水逐漸被排出和吸收后復(fù)篩時將通過聽力篩查。部分新生兒還會因為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不成熟導(dǎo)致AABR篩查不能通過，隨著新生兒月份的增長，神經(jīng)系統(tǒng)逐步發(fā)育成熟后對刺激更加敏感，復(fù)篩時聽力篩查將通過。本研究結(jié)果可見，隨著新生兒出生月份的增長，部分新生兒尤其第一次評估為輕度聽力下降的新生兒聽力逐漸恢復(fù)正常。

2007年我國開始試點實施新生兒聽力和聾病易感基因聯(lián)合篩查后，已取得重大成效，部分聽力篩查不能早期發(fā)現(xiàn)的遲發(fā)性耳聾患者被確立并做到目標(biāo)性隨訪。本研究確診的10例聽力損失的新生兒中，2例為GJB2基因c.235delC純合突變，分別為中、重度耳聾。由GJB2基因突變引起的耳聾的發(fā)生率約為20%［8］，且GJB2基因c.235delC純合突變在新生兒出生時即可表現(xiàn)出聽力損失，所以對GJB2基因c.235delC純合突變新生兒可以早期給予相應(yīng)的干預(yù)，也可以對家長給予充分明確的解釋。這2例GJB2c.235delC純合突變新生兒，均于出生后6個月內(nèi)選配了合適的助聽器，經(jīng)語訓(xùn)后取得了理想的效果。另外，本研究發(fā)現(xiàn)的4例GJB2基因c.235delC雜合突變患兒，隨訪至今沒有出現(xiàn)聽力損失，但很多研究報道，GJB2基因雜合突變會出現(xiàn)遲發(fā)性的高頻聽力下降，因此必須堅持長期隨訪，一旦出現(xiàn)聽力損失，及時給予相關(guān)的干預(yù)，將聽力損失控制在最低限度，防止聾啞的發(fā)生。另外，此4例雜合攜帶者若日后與相同基因型攜帶者婚配將有25%的概率產(chǎn)生耳聾后代，對他們進(jìn)行婚育指導(dǎo)可防止耳聾后代的發(fā)生。可見，對這類人群進(jìn)行相關(guān)基因篩查具有長遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義，這是單純聽力篩查無法做到的。

線粒體12Sr RNAm.A1555G陽性新生兒出生時可表現(xiàn)為聽力正常，日后若使用氨基糖苷類抗生素會出現(xiàn)“一針致聾”的情況，所以只有通過基因篩查才能做到早期發(fā)現(xiàn)和早期預(yù)防。據(jù)報道，線粒體12Sr RNAm.A1555G突變在新生兒中的發(fā)生率約為5%～12%［9～11］，本研究由于研究對象較少，未發(fā)現(xiàn)該基因突變者，所以，擴(kuò)大篩查范圍非常必要。本研究發(fā)現(xiàn)1例SLC26A4 c.919－2A＞G雜合攜帶者，由于SLC26 A4基因片段較大，極具異質(zhì)性，21個外顯子都有可能發(fā)生突變，而本研究目前僅針對最易發(fā)生突變的P8外顯子進(jìn)行篩查，很有可能同時存在其他外顯子的突變，也就是說該例c.919－2A＞G雜合攜帶者不能排除復(fù)合雜合的可能。復(fù)合雜合攜帶者對聽力的影響與純合突變一樣，出生時可表現(xiàn)為聽力正常，或者輕～重度聽力損失，感冒、顱腦震蕩等因素可誘發(fā)聽力損失或進(jìn)一步的聽力下降，所以，對該例SLC26A4基因c.919－2A＞G雜合攜帶者必須長期隨訪，避免上述誘因，預(yù)防耳聾的發(fā)生，一旦出現(xiàn)耳聾，及時干預(yù)。國人大前庭水管患者SLC26A4基因研究表明，92.1%的中國患者存在該基因的突變［12］。所以，擴(kuò)大和推廣新生兒聾病易感基因篩查是非常必要的。

綜上所述，新生兒聽力聯(lián)合聾病易感基因篩查，能發(fā)現(xiàn)部分單純聽力篩查不能發(fā)現(xiàn)的遲發(fā)性耳聾高危患兒，擴(kuò)大重點隨訪－干預(yù)對象，若干年后將大大降低聾啞的發(fā)生率，有長遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義，具有可行性。但目前仍有大量耳聾基因未被定位和克隆，并不是所有的新生兒聽力損失都能通過基因篩查被發(fā)現(xiàn)，故基因篩查并不能代替新生兒聽力篩查。

1 郭玉芬，關(guān)靜，徐百成，等.甘肅省盲聾啞學(xué)校283名聾啞學(xué)生的病因分析［J］.中華耳科學(xué)雜志，2006，4：30.

2 王秋菊，趙亞麗，蘭蘭，等.新生兒聾病基因篩查實施方案與策略研究［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，42：809.

3 孫喜斌，李興啟，張華.中國第二次殘疾人抽樣調(diào)查聽力殘疾標(biāo)準(zhǔn)介紹［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2006，14：447.

4 Lin HC，Shu MT，Lee KS.comparison of hearing screening programs between one step with transient otoacoustic emission（TEOAE）and two step with TEOAE and auto－auditory brainstem response［J］.Laryngoscope，2005，115：1 957.

5 賀鷺，曲成毅，孫喜斌.應(yīng)用耳聲發(fā)射技術(shù)對48041名新生兒進(jìn)行聽力篩查的匯總分析［J］.中國聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志，2005（1）：21.

6 Stewart DL，Mehl A，Hall JW，et al.Universal newborn hearing screening with automated auditory brainstem response：A multisite investigation［J］.J Perinatol，2000，20：S128.

7 Joint Commitee on infant hearing.Year 2000 position statement：principles and guidelines for early hearing detection and intervention programs［J］.Pediatrics，2000，106：798.

8 王秋菊.新生兒聾病易感基因篩查的意義與策略［J］.中國醫(yī)學(xué)文摘耳鼻咽喉科學(xué)，2007，22：21.

9 王秋菊，韓東一，郭玉芬，等.遺傳性耳聾資源收集保存及基因定位克隆［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2006，13：661.

10 管敏鑫，趙立東.與氨基糖甙類抗生素耳毒性相關(guān)的線粒體12S rRNA突變的流行病學(xué)特征［J］.中華耳科學(xué)雜志，2006，4：98.

11 郭玉芬，徐百成，韓東一，等.中國西北地區(qū)線粒體DNA 12Sr RNAA1555G和GJB2基因突變［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2006，13：666.

12 趙亞麗，李慶忠，翟所強(qiáng)，等.國人前庭水管擴(kuò)大患者SLC26A4基因的特異性突變［J］.聽力學(xué)及言語疾病雜志，2006，14：93.

（2010－04－26收稿）

（本文編輯 雷培香）

The SusceptibiIity Genes in FaiIed Newborns in Hearing Screening Programs

Zhou JiaIin*，Li Jianqiang，Luo Renzhong，Wang Dayong，Wen Reijin，Ji Yubing，Wang Qiuju
（*Department of OtoIaryngoIogy，Guangzhou ChiIdren＇s HospitaI，Guangzhou，510120，China）

Objective To discuss and analyze the clinical significance of combined genetic and hearing screenings administered to newborns failed hearing re－screening in the identification of newborn hearing impairment.Methods 200 newborn babies in Guangzhou from December 2006 to May 2007，after failure of the hearing rescreening，received the audiological assessment and medical diagnosis.Otoacoustic emission（OAE），auto－auditory brainstem response（AABR），and 40 Hz－AERP were employed as part of the audiological protocol.Newborn genetic disease screening cards were used to collect the blood samples from the umbilical cords within three months.The cards could directly perform the polymerase chain reaction（PCR）for screening the mitochondrial 12Sr RNAm.A1555G and GJB gene as well as SLC26A4c.919－2A＞G genes mutation.The restriction enzyme Alw26I was used to recognize the point mutation of 12Sr RNAm.A1555G.The samples with the possible 12Sr RNAm.A1555G mutation were then sequenced for verification.The PCR products from the GJB2 coding region and SLC26 A4 c.919－2A＞G mutations hot spot region were sequenced directly.The software of DNAStar was used to analysis the sequence.ResuIts For 200 failed babies，190 babies passed re－screening but 10 were confirmed with hearing loss.In these，4 babies were confirmed with bilateral hearing loss，including 2 babies showing GJB2c.235delC genotype in the gene screening，and 6 babies were confirmed with unilateral hearing loss.The newborn gene screening results indicate that GJB2 genetic screening identified 6 cases for 235delC genotype，3%，including 4 cases for 235delC heterozygous，2%，2 cases for 235delC homozygous，1%.SLC26A4 gene screening，and 1 case for SLC26A4 c.919－2 A＞G heterozygous.No case for 12Sr RNAm.A1555G mutation was found.ConcIusion The newborn gene screening may approve to be a valuable addition into the hearing screening protocol in order to identify early hearing loss for effective management.

Newborns； Hearing screening； Genes； OAE； AABR

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.005

R764.44

A

1006－7299（2011）01－0014－04

△ 國家863項目（2006AA02Z181）、國家自然基金重點項目（30830104）、國家自然基金面上項目（30672310＆30771203）、北京市重大專項課題項目（7070002）、國家“十一五”科技支撐計劃（2006BAI02B06＆2007BAI18B12）、廣州市科技攻關(guān)計劃重大項目（2005Z1－E0105）、廣東省科技廳社會發(fā)展計劃項目（2008－108－83088）聯(lián)合資助

1 廣州市兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科（廣州 510120）； 2 解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所（北京 100853）

周佳霖，女，浙江人，醫(yī)師，主要從事臨床聽力學(xué)及分子遺傳學(xué)的研究。周佳霖，歷建強(qiáng)為并列第一作者。

王秋菊（Email：wqcr＠263.net）； 羅仁忠（Email：luorenzhong＠21cn.com）

新生兒聽力聯(lián)合聾病易感基因篩查，能發(fā)現(xiàn)部分單純聽力篩查不能發(fā)現(xiàn)的遲發(fā)性聽力損失高危患兒，擴(kuò)大重點隨訪對象。