非綜合征型聾患者耳聾相關(guān)基因檢測結(jié)果分析*

梁爽 孫喜斌 韓睿 焦玉勤 王艷霄 鄒建華 顏曉蓉 于麗玫

非綜合征型聾患者耳聾相關(guān)基因
檢測結(jié)果分析*

梁爽1孫喜斌1韓睿1焦玉勤1王艷霄1鄒建華2顏曉蓉3于麗玫1

目的 探討遺傳性耳聾基因芯片用于非綜合征型聾患者檢測的臨床意義。方法 采用遺傳性聾基因芯片試劑盒對177例非綜合征型耳聾患者基因組DNA的GJB2、SLC26 A4、GJB3和mtDNA12s r RNA四個(gè)耳聾相關(guān)基因的9個(gè)致聾突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測；對部分?jǐn)y帶SLC26A4基因突變的患者進(jìn)行顳骨CT掃描；選取26位聽力正常且無耳聾家族史的受檢者作為正常對照。結(jié)果 ①在非綜合征型耳聾患者中攜帶耳聾相關(guān)基因突變者占49.15%；②11例SLC26A4基因突變攜帶者顳骨CT均顯示前庭水管擴(kuò)大；③正常對照組隱性突變基因攜帶率為7.7%。結(jié)論 遺傳因素在非綜合征型耳聾的致聾病因中所占的比例較高，大前庭水管綜合征患者的SLC26 A4基因檢測結(jié)果與其顳骨影像學(xué)檢查結(jié)果吻合。

耳聾； 基因檢測； 基因芯片； 非綜合征型聾

隨著人們對遺傳性耳聾認(rèn)識的逐漸深入，耳聾基因檢測已經(jīng)成為預(yù)防和阻斷遺傳性聾的重要措施。自2008年9月以來，本課題組共對177例非綜合征型聾患者及26例正常對照組進(jìn)行了GJB2、SLC26A4、GJB3和mt DNA12s r RNA四個(gè)耳聾相關(guān)基因的檢測，現(xiàn)將初步結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 檢測對象 非綜合征型耳聾患者177例，其中男81例，女96例；年齡最小5個(gè)月，最大38歲，平均11±9.2歲；所有患者均為雙耳感音神經(jīng)性聾，除9例為中度外，其余均為重度－極重度。患者地域分布廣泛，遍布全國28個(gè)省、直轄市、自治區(qū)。所有病例均在醫(yī)生指導(dǎo)下填寫“耳聾病人信息登記表”，獲取耳聾相關(guān)信息，包括患兒的一般信息、出生史、耳聾發(fā)病年齡、家族史、個(gè)人史（耳聾前傳染病史、耳毒性藥物應(yīng)用史、頭部外傷史等）、母孕期情況等。所有患者或家長均簽署知情同意書。

另外選取26位聽力正常且無耳聾家族史的志愿者作為正常對照組。其中，男15例，女11例；年齡最小12歲，最大28歲，平均20±4.6歲；來自全國14個(gè)省、直轄市、自治區(qū)。所有正常對照組人員均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 DNA提取方法 采集受檢者外周血3 ml，應(yīng)用試劑盒提取DNA（北京天根生化科技有限公司），試劑盒方法提取步驟參照試劑盒提供的使用說明進(jìn)行。取2μl DNA用核酸定量儀進(jìn)行濃度和純度檢測，其余保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 耳聾基因芯片檢測方法 應(yīng)用遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒（博奧生物有限公司，北京）對GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA12s r RNA四個(gè)耳聾相關(guān)基因的9個(gè)致聾突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測。該試劑盒以基因組DNA為模板，采用帶有Tag標(biāo)簽序列的基因位點(diǎn)特異性引物對相關(guān)突變位點(diǎn)所在的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和熒光標(biāo)記，然后與能夠識別相應(yīng)標(biāo)簽序列的基因芯片進(jìn)行雜交，最后通過軟件對芯片進(jìn)行掃描和數(shù)據(jù)分析，得到9個(gè)突變位點(diǎn)的檢測結(jié)果。基因芯片采用微量點(diǎn)樣技術(shù)，將檢測突變位點(diǎn)的通用探針與各種對照探針固定在經(jīng)過化學(xué)修飾的基片上，每一個(gè)檢測探針重復(fù)5個(gè)點(diǎn)，每一個(gè)對照探針重復(fù)5、10或15個(gè)點(diǎn)，形成11行×15列的微陣列，每張芯片上有4個(gè)同樣的微陣列，每個(gè)微陣列可以檢測一份樣品［1］。

1.2.3 顳骨CT檢查 對11例SLC26A4基因突變攜帶患者進(jìn)行16排螺旋CT顳骨掃描，層厚／層距（mm）：0.6／0.6，窗寬4 000 HU，窗位700 HU，掃描范圍以聽眶上線為基線向上連續(xù)掃描。

2 結(jié)果

2.1 177例非綜合征型耳聾患者的基因芯片檢測結(jié)果 177例耳聾患者中，發(fā)現(xiàn)攜帶遺傳性耳聾相關(guān)突變基因的患者87例（49.15%，87／177），其中GJB2基因突變攜帶者47例（26.55%，47／177）、SLC26A4基因突變攜帶者35例（19.77%，35／177）、mtDNA12s r RNA線粒體基因突變攜帶者4例（2.26%，4／177），GJB3基因突變攜帶者1例（0.56%，1／177）（表1）。GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者占基因突變總例數(shù)的94.25%（82／87）。這87例中9例為中度感音神經(jīng)性聾，其余均為極重度感音神經(jīng)性聾。4例mt DNA12s r RNA線粒體基因突變攜帶者中，2例家族史不詳，2例攜帶有mtDNA12Sr RNA基因第1555位A－G均質(zhì)性突變，均有耳毒性藥物使用史和母親藥物性聾家族遺傳史，其中1例患者的孩子也是12Sr RNA基因第1555位A－G均質(zhì)性突變攜帶者，因?yàn)闆]有使用過氨基糖苷類抗生素，聽力正常。2個(gè)家庭的基因型－表型－家族史均一致，為母系遺傳性藥物中毒性耳聾。一例基因芯片檢測結(jié)果為SLC26 A4基因IVS7－2 A－G純合突變的患者，以序列分析方法進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果與芯片結(jié)果一致（圖1）。

表1 177例非綜合征耳聾患者中4種耳聾相關(guān)突變基因檢出率

圖1 一例基因芯片檢測結(jié)果為SLC26A4基因IVS7－2 A－G純合突變患者的測序圖

2.2 47例GJB2基因突變攜帶者檢測結(jié)果 47例GJB2基因突變陽性者中，可以明確該隱性基因2個(gè)突變位點(diǎn)攜帶者的比例為72.34%（34／47），分別是235delC純合突變23例，35del G／299＿300del AT復(fù)合突變1例，299＿300del AT純和突變1例，235delC／176del16復(fù)合突變1例，35del G／235delC復(fù)合突變1例，235delC／299＿300del AT復(fù)合突變7例；只能明確該隱性基因中1個(gè)突變位點(diǎn)的攜帶者的比例為27.66%（13／47），分別是235del C雜合突變10例，35del G雜合突變1例，299＿300del AT雜合突變2例。

2.3 35例SLC26A4基因突變攜帶者檢測結(jié)果35例SLC26A4基因突變陽性者中，可以明確該隱性基因2個(gè)突變位點(diǎn)攜帶者的比例為34.29%（12／35），分別是IVS7－2 A＞G純合突變9例，IVS7－2A＞G／2168A＞G復(fù)合突變3例；只能明確該隱性基因中1個(gè)突變位點(diǎn)攜帶者的比例為65.71%（23／35），分別是IVS7－2A＞G雜合突變19例，2168A＞G雜合突變4例。

2.4 大前庭水管綜合征患者基因檢測與影像學(xué)結(jié)果對比 35例SLC26 A4基因突變攜帶者中，11例接受顳骨CT檢查，均顯示前庭水管擴(kuò)大，其外口和總腳間中點(diǎn)直徑＞1.8 mm，前庭水管與半規(guī)管總腳相通。這些患者的耳聾基因芯片檢測結(jié)果分別是IVS7—2 A＞G純合突變3例，IVS7—2 A＞G雜合突變5例，2168A＞G雜合突變2例，IVS7—2A＞G／2168 A＞G復(fù)合突變1例。

2.5 聽力正常對照組基因芯片檢測結(jié)果 26例正常對照組中，2例為GJB2基因雜合突變攜帶者，未發(fā)現(xiàn)SLC26 A4、GJB3以及線粒體基因突變攜帶者，陽性率為7.69%（2／26）。

3 討論

按照不同的遺傳方式可將遺傳性耳聾分為：①常染色體顯性遺傳性聾；②常染色體隱性遺傳性聾；③線粒體基因突變引起的耳聾；④伴性遺傳性聾。一般認(rèn)為，耳聾患者中50%是由遺傳物質(zhì)發(fā)生改變導(dǎo)致的［2］，研究表明，中國聾人中GJB2、SLC26A4和mt DNA12s r RNA基因突變導(dǎo)致的耳聾比例非常高［3］。本研究中在非綜合征型感音神經(jīng)性聾患者中的耳聾相關(guān)基因突變陽性檢出率為49.15%，其中GJB2和SLC26A4這兩類基因突變在基因突變總體病例中所占的比例為94.25%，與文獻(xiàn)［3］報(bào)道一致。GJB2和SLC26 A4遺傳方式均為常染色體隱性遺傳，即來自父母雙方的染色體均攜帶致聾基因突變時(shí)（純合或復(fù)合雜合突變），子代才表現(xiàn)出耳聾；如果僅有父源或母源染色體攜帶致聾基因突變，子代只是聽力健康的該類基因突變攜帶者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，GJB2和SLC26A4兩個(gè)隱性突變基因在正常人群中的攜帶率約為4%［3，4］，文中正常對照組的陽性率為7.7%。如果父母雙方均為攜帶者，雖然他們不會(huì)表現(xiàn)出耳聾，但其子女出現(xiàn)耳聾的可能性可高達(dá)25%，成為攜帶者的可能性為50%，完全正常的可能性為25%；如果一方是遺傳性耳聾，另一方為正常人，則其子女均不出現(xiàn)遺傳性耳聾，但均是攜帶者；如果雙方均是同型遺傳性耳聾患者，則其子女出現(xiàn)耳聾的可能性為100%［5］。因此，已育有GJB2和SLC26A4兩個(gè)隱性基因致聾患兒的家庭是預(yù)防耳聾患者出生的重點(diǎn)對象；聾兒父母雙方家族內(nèi)的一級、二級親屬具有25%～50%的機(jī)會(huì)成為耳聾突變基因攜帶者，均是預(yù)防的次重點(diǎn)對象。

目前，高分辨顳骨CT是診斷大前庭水管綜合征的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是應(yīng)用CT診斷大前庭水管綜合征仍然存在一定的局限性，國內(nèi)仍有部分醫(yī)院并不具備診斷大前庭水管的影象學(xué)條件以及相應(yīng)的知識和技術(shù)；再加上由于該病患兒早期的輕度聽力損失有可能被家長忽略，從而失去了顳骨CT檢查以早期明確診斷的機(jī)會(huì)。因此，部分大前庭水管綜合征患者不能得到及時(shí)的診斷。多項(xiàng)研究表明大前庭水管綜合征的發(fā)病與SLC26A4基因突變具有直接的因果關(guān)系［6～8］。本研究患者組中，SLC26A4基因突變在基因突變總體病例中所占的比例為40.23%（35／87），其中11例陽性病例接受了顳骨CT檢查，均顯示前庭水管擴(kuò)大。可見，對于疑為大前庭水管綜合征的患者，可以通過SLC26A4基因突變的檢測，早期明確診斷。

由于大前庭水管綜合征具有波動(dòng)性遲發(fā)性聽力下降的特點(diǎn)，應(yīng)避免患兒參與轉(zhuǎn)圈、翻跟斗等游戲，避免頭部外傷、震蕩、感冒等聽力下降的誘因，保護(hù)患兒的殘余聽力，預(yù)防耳聾加重。

遺傳性耳聾患者中，GJB2基因突變發(fā)生率很高。據(jù)調(diào)查，約有49%的白種人家族性常染色體隱性遺傳的耳聾是由GJB2突變導(dǎo)致的［9，10］。解放軍總醫(yī)院全國聾病分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，在中國聾人群體中21.05%的患者攜帶GJB2基因突變［11］。本研究患者組中，26.55%的患者攜帶GJB2基因突變，占耳聾基因突變總體病例的54.02%（47／87）。

GJB2基因突變方式較多，目前，已發(fā)現(xiàn)其突變方式有91種［12］。白種人以35delG為多（70%），我國學(xué)者報(bào)道GJB2基因在中國人中的主要突變方式為235delC［11］。從文中結(jié)果看，GJB2基因突變的攜帶者47例，其中235delC攜帶率最高，與文獻(xiàn)報(bào)道相同［2，11，13，14］。

從遺傳學(xué)角度分，氨基糖苷類藥物中毒性耳聾可分為兩種：一種為非遺傳性耳聾，患者由于用藥劑量過大導(dǎo)致耳聾，不會(huì)遺傳給子代；另一種為線粒體基因突變導(dǎo)致的母系遺傳性耳聾。Fischel等［15，16］研究發(fā)現(xiàn)后者與mt DNA12Sr RNA基因第1555位A－G均質(zhì)性點(diǎn)突變有關(guān)，單次劑量的氨基糖苷類藥物應(yīng)用即可導(dǎo)致攜帶此突變個(gè)體的重度聽力損失。戴樸等［17］報(bào)道了14個(gè)母系遺傳耳聾家系，證實(shí)13個(gè)家系中33個(gè)耳聾患者攜帶有mtDNA12Sr RNA基因第1555位A－G均質(zhì)性突變。王秋菊等［18］在一個(gè)由母系遺傳的氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致非綜合征型耳聾的中國大家系中，在12S r RNA基因的1494位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)同質(zhì)性的C－T轉(zhuǎn)換。本研究中，2例攜帶有mtDNA12Sr RNA基因第1555位A－G均質(zhì)性突變，均有耳毒性藥物使用史和母親耳毒性藥物性耳聾的家族遺傳史，2個(gè)家庭的基因型－表型－家族史均一致，為母系遺傳性藥物中毒性耳聾，通過對所有母系成員進(jìn)行用藥宣教，終生禁用氨基糖苷類抗生素，可有效避免藥物性耳聾的發(fā)生。

由于遺傳性耳聾的遺傳背景比較復(fù)雜，傳統(tǒng)的耳聾基因檢測方法昂貴而且耗時(shí)。耳聾基因芯片方法，將等位基因辨別反應(yīng)通過多重等位基因特異性PCR在液相中實(shí)現(xiàn)，然后利用固定了不同標(biāo)簽（Tag）探針的固相通用芯片將PCR結(jié)果展現(xiàn)出來，快速、簡便、高效，該技術(shù)在樣本較大的人群篩查工

作中有其它檢測技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢。但目前該耳聾基因芯片上涵蓋的位點(diǎn)有限，有些病例不能給予明確診斷，結(jié)果為雜合的情況下需進(jìn)一步測序，確定是否為復(fù)合突變導(dǎo)致的遺傳性耳聾。本研究發(fā)現(xiàn)，通過耳聾基因芯片檢測，GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者中，分別僅有72.34%和34.29%的患者可以明確其基因突變位點(diǎn)，而其余病例需要測序以進(jìn)一步提高診斷率，此項(xiàng)工作正在進(jìn)行中。

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（2010－07－27收稿）

（本文編輯 周濤）

Deafness Gene Mutations AnaIysis in Cases with Non－syndromic Deafness Liang Shuang，Sun Xibin，Han Rui，Jiao Yuqin，Wang Yanxiao，

Zou Jianhua，Yan Xiaorong，Yu Limei
（China RehabiIitation and Research Center for Deaf ChiIdren，Beijing，100029，China）

Objective To investigate the clinical significance of gene mutations detecting by gene chip in non－syndromic deaf patients.Methods Nine mutations of four genes（GJB2，SLC26A4，GJB3 and mtDNA12s rRNA），from 177 hearing impaired patients and 26 volunteers with normal hearing，were detected by using Capital Bio Deafness Gene Mutation Detection Array Kit.Some of the SLC26A4 related hearing impaired patients accepted CT examination.ResuIts ①Among the 177 patients with non－syndromic hearing loss，49.2%patients carried mutations of deafness related genes：GJB2（26.6%），SLC26A4（19.8%），mtDNA 12s rRNA（2.3%）and GJB3（0.6%），respectively.②CT scan results showed that SLC26 A4 related patients were all with large vestibular aqueduct syndrome.③The carriers accouned for 7.7%in the nomal group.ConcIusion ①Our results indicate that genetic factors account for about 50%in the hearing impaired population.②The genotype and imaging examination are consistent in large vestibular aqueduct syndrome cases.

Deafness； Genetic testing； Gene Chip； Non－syndromic deafness

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.01.004

R764.44

A

1006－7299（2011）01－0010－04

* 國家社會(huì)科學(xué)基金重大項(xiàng)目（09＆ZD072）、十一五國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目《中國殘疾預(yù)防對策研究》（2008BAI50B01）聯(lián)合資助1 中國聾兒康復(fù)研究中心（北京100029）； 2 廣東省聾兒康復(fù)中心；3 福建省殘疾人康復(fù)職業(yè)培訓(xùn)中心

梁爽

孫喜斌（Email：sunxibin321＠gmail.com），于麗玫（Email：limeiyu＠vip－sina.com）