NM23-H1、CD44v6在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

魏明超 ，岳世昌，王齊敏，王乃玉

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 胸外科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116027)

肺癌為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中大部分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，占了80%。大部分患者在就診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，耽誤甚至錯(cuò)過(guò)了最佳的治療時(shí)機(jī)。因而，對(duì)早期肺癌患者有效治療顯得尤為重要。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌(N0NSCLC)為臨床適應(yīng)手術(shù)治療的肺癌，判斷這部分腫瘤患者的預(yù)后，對(duì)抉擇術(shù)后治療方案十分重要。NM23-H1和CD44v6都是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子，本研究檢測(cè)NM23-H1、CD44v6在術(shù)后病理證實(shí)為N0NSCLC組織的表達(dá)，通過(guò)分析二者表達(dá)與患者5年預(yù)后的關(guān)系，探討它們用于預(yù)測(cè)N0NSCLC預(yù)后的可能性。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及臨床資料

取大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胸外科2000～2005年間經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)N0NSCLC組織60例。其中，男性40例，女性20例；最大年齡77歲，最小年齡50歲，平均年齡59歲；鱗癌33例，腺癌27例。術(shù)前所有患者均未行放療或化療治療。術(shù)后60例患者均通過(guò)復(fù)查或電話(huà)密切隨訪,期限5年。復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及該病死亡為終點(diǎn)事件。

1.2 試 劑

所用I抗均為即用型工作液，分別為：鼠抗人NM23-H1單克隆抗體，克隆號(hào)37.6；鼠抗人CD44v6單克隆抗體，克隆號(hào)VFF-7。SP試劑盒為sp-9000型通用型試劑盒，DAB染色試劑盒為ZLI-9032型試劑盒，所有試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 方 法

采用免疫組織化學(xué)法對(duì)60例NSCLC標(biāo)本分別進(jìn)行NM23-H1、CD44v6檢測(cè)。主要步驟：將切除肺癌組織行常規(guī)福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm切片。將石蠟切片置60 ℃烤箱1 h，免疫組化步驟按照試劑盒要求進(jìn)行；最后中性樹(shù)脂封片。

1.4 結(jié)果判定

NM23-H1呈棕黃色染色定位于胞漿；CD44v6呈棕黃色顆粒狀主要定位于胞膜，部分定位于胞漿。選取染色密集區(qū)，隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡(400×)視野。采用半定量積分法，按染色強(qiáng)度分為：無(wú)染色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；按染色細(xì)胞數(shù)：<25%弱陽(yáng)性為1分；25%～50%中等陽(yáng)性為2分，>50%強(qiáng)陽(yáng)性為3分。兩者相乘，0～3分為陰性，4～5分為陽(yáng)性(+)，6～7分為中等陽(yáng)性(++)，8～9分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。切片由3位病理醫(yī)師分別評(píng)分，最后取平均值。用本院已知陽(yáng)性NSCLC陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替I抗為陰性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

比較各指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)在病理分型中有無(wú)差異性采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用kaplan-meier曲線(xiàn)圖示，行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)；各指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)與5年預(yù)后相關(guān)性采用秩相關(guān)(r)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在 N0NSCLC當(dāng)中，NM23-H1陽(yáng)性表達(dá)率為66.67%，該部分患者術(shù)后5年生存率為72.50%， 而NM23-H1陰性者為20.00%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得出χ2=14.37 (P<0.01)，差異有顯著性意義。可以認(rèn)為，NM23-H1陽(yáng)性者5年生存率要明顯高于NM23-H1陰性者；經(jīng)檢測(cè)NM23-H1陽(yáng)性表達(dá)與術(shù)后5年存活率呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.887，相關(guān)性較高，但其在鱗癌與腺癌中的表達(dá)差異無(wú)顯著性意義(χ2=2.72，P<0.05)。

在 N0NSCLC當(dāng)中，CD44v6陽(yáng)性表達(dá)率為35%，該部分患者術(shù)后5年生存率為28.57%，CD44v6陰性表達(dá)者為69.23%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得出χ2=9.56 (P<0.01)，差異具有顯著性意義。可以認(rèn)為CD44v6陽(yáng)性者術(shù)后5年生存率要低于CD44v6陰性者；CD44v6陽(yáng)性表達(dá)與存活率呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為-0.784，但其在鱗癌與腺癌中的表達(dá)差異無(wú)顯著性意義(χ2=1.77 ，P<0.05)。

具體見(jiàn)表1、2及圖1～3。

表1 兩指標(biāo)表達(dá)強(qiáng)度及術(shù)后5年存活率的關(guān)系

表2 兩指標(biāo)表達(dá)與病理分型關(guān)系

圖1 各組生存函數(shù)

圖2 鱗癌NM23-H1漿表達(dá) 200×

圖3 鱗癌CD44v6膜表達(dá) 200×

3 討 論

NM23(nonmetatasis23，nm23)基因是Steeg等[1]在1988年用消減雜交法從不同轉(zhuǎn)移潛能的鼠黑色素瘤K-1735細(xì)胞株中克隆到的一種有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用的基因，分為NM23-H1、NM23-H2、DR-NM23和NM23-H4四型，其中與腫瘤預(yù)后關(guān)系較為密切的就是NM23-H1，定位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂，其表達(dá)產(chǎn)物主要存在于胞漿當(dāng)中。現(xiàn)有的研究表明，NM23基因的表達(dá)水平、基因缺失、突變與腫瘤的臨床病理生理指標(biāo)和預(yù)后有一定的內(nèi)在聯(lián)系，如在乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤中，NM23-H1的低表達(dá)與預(yù)后不良密切相關(guān)；但在其他腫瘤當(dāng)中，有文獻(xiàn)報(bào)道NM23-H1的高表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[2]，這可能與其選取的樣本及腫瘤的特異性有關(guān)。目前，主要是將NM23-H1作為一種抑癌基因來(lái)研究，它的低表達(dá)可以影響微管的聚合與解聚，使微管微絲聚合受阻導(dǎo)致紡錘體形成障礙，促使非整倍體細(xì)胞的形成而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡變[3]；NM23-H1還可以影響G蛋白[4]的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)大量的G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)而負(fù)性調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，可以將檢測(cè)NM23-H1作為一種早期診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)[5-7]、甚至基因治療的手段來(lái)應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，NM23-H1的表達(dá)直接與患者的預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)越高表明患者的預(yù)后越好，生存期越長(zhǎng)；其表達(dá)越低，生存期越短。

CD44為一種分布極為廣泛的細(xì)胞表面跨膜蛋白，是一個(gè)重要的細(xì)胞表面粘連分子，可以與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸、層粘連蛋白等基質(zhì)分子結(jié)合；還能與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞偽足形成，并與細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)有關(guān)[7,8]。它的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域十分保守，這一結(jié)構(gòu)區(qū)域稱(chēng)為糖脂富集膜微結(jié)構(gòu)域，胞漿側(cè)的羧基尾還可介導(dǎo)CD44蛋白從胞漿至胞膜的轉(zhuǎn)移，所以CD44蛋白可以在胞漿及胞膜同時(shí)表達(dá)。人類(lèi)的CD44基因定位于11號(hào)染色體短臂，它有20個(gè)高度保守的外顯子構(gòu)成。根據(jù)外顯子的轉(zhuǎn)錄方式不同，又分為組成型外顯子(C)和變異型拼接外顯子(V)兩大類(lèi)。組成型外顯子共有10個(gè)，存在于所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之中。僅含有組成外顯子的CD44轉(zhuǎn)錄子稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)CD44(CD44S)；變異型拼接外顯子也有10個(gè)，僅含有變異性拼接外顯子的CD44轉(zhuǎn)錄子稱(chēng)為變異CD44(CD44v)。變異性CD44特別是CD44v6型可連續(xù)性轉(zhuǎn)錄[9,10]，從而使其表達(dá)產(chǎn)物大量表達(dá)，加劇了腫瘤細(xì)胞的遷移[11]。本研究表明，CD44v6陽(yáng)性者生存期短，生存率低，預(yù)后較差，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[12,13]。因此，可以通過(guò)檢測(cè)CD44特別是CD44v6的表達(dá)揭示其與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系。可以將CD44v6作為臨床預(yù)測(cè)患者預(yù)后的重要指標(biāo)，以便于制定針對(duì)性較強(qiáng)的治療方案。

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