強力霉素對糖尿病小鼠肌肉轉染人胰島素基因的調控作用

劉海霞，李 鴻，蘇本利

(大連醫科大學附屬第二醫院內分泌科，遼寧大連 116027)

強力霉素對糖尿病小鼠肌肉轉染人胰島素基因的調控作用

劉海霞，李 鴻，蘇本利

(大連醫科大學附屬第二醫院內分泌科，遼寧大連 116027)

［目的］研究強力霉素對糖尿病小鼠肌肉轉染人胰島素基因表達的調控作用。［方法］構建prTA-tet4-rhINS質粒;以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導昆明小鼠成糖尿病模型。采用電穿孔法轉移質粒prTA-tet4-rhINS，通過強力霉素(doxcycline，Dox)水給藥/撤除以評價四環素系統調控人胰島素表達的可行性。檢測末梢血糖，血清人真胰島素及小鼠肌肉組織人胰島素原基因mRNA表達情況。［結果］電穿孔轉染目的質粒胰島素后，立即予飲Dox水，可在小鼠肌肉組織中檢測到mRNA表達，第2周降糖效果最佳，撤除強力霉素后，血糖回升，于48 h升至轉染前水平，再次予飲Dox水后，血糖逐漸下降，72 h內達到撤藥前水平。重復給藥/撤藥兩次結果一致。［結論］通過給藥/撤除Dox可以實現對人胰島素原基因表達的開關調控。

四環素調控系統;胰島素;糖尿病;基因治療

1型糖尿病的病因為體內胰島素絕對缺乏，故患者須終生應用胰島素。基因治療糖尿病始終為研究熱點，它是將胰島素基因直接導入患者體內，長期產生有生物活性的胰島素。胰島素如產生過量勢必有發生低血糖的風險，因此，胰島素基因的表達調控則是基因治療成功的基本保障。四環素(tetracycline，Tet)調控的基因表達系統是近年來發展的人類基因治療中可接受的一種表達調控系統［1］。本實驗通過構建可由四環素衍生物強力霉素調控的人胰島素原基因(prTA-tet4-rhINS)表達載體，研究基因導入后胰島素基因在糖尿病小鼠骨骼肌中的表達水平及活性，通過糖尿病小鼠飲用水中強力霉素(doxcycline，Dox)的給藥/撤除以評價四環素系統中的Tet-on系統對人胰島素基因表達的開關、調控作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑:質粒 pLNCX購自美國 Clontech公司，pINS-ABC(帶有furin酶切位點的重組人胰島素原基因)［2］由西班牙巴塞羅那大學獸醫院Fatima Bosch教授惠贈，pUHG102-8、pUHrT2-1(四環素抗性基因操縱子系統)［3］由德國Heidelberg大學H.Bujard教授惠贈。鏈脲佐菌素(STZ)、強力霉素(doxcycline)及DEPC水均購自sigma公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。RT-PCR所用引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。DL-2000，λ-HindⅢ分子量標準購自寶生物工程(大連)有限公司。人胰島素ELISA試劑盒購自美國BIOSOURCE公司，敏感度為0.15 μIU/mL，與人胰島素的交叉反應為100%，與人胰島素原及大鼠胰島素的交叉反應為0%。

1.1.2 主要器材:血糖儀及試紙(葡萄糖氧化酶法，美國羅氏公司)，DNA擴增儀(美國PE公司)，TS-B轉基因儀(北京醫科大學儀器廠)，酶標儀(芬蘭Thermo Labsystems公司)，M-26型紫外光透照儀(美國)。

1.1.3 實驗動物:昆明種小鼠150只，雄性，8～10周齡，體重(28±2)g購自大連醫科大學實驗動物中心，實驗動物飼養及實驗經過大連醫科大學醫學倫理學委員會批準。

1.2 方 法

1.2.1 質粒的構建，擴增和提取:pINS-ABC帶有furin酶切位點的重組人胰島素原基因，能夠在成肌細胞成熟為胰島素，通過基因重組將重組人胰島素原基因構建為prTA-tet4-rhINS，電轉至感受態大腸桿菌JM109中，堿裂解法提取質粒，聚乙二醇沉淀法進行純化，并對插入的rhINS片段進行限制性內切酶酶切鑒定和直接測序［4］。

1.2.2 糖尿病小鼠模型的建立及質粒的轉染:150只昆明小鼠，每只小鼠以120 mg/kg腹腔注射新鮮配制的1.5%STZ溶液(pH 4.1)。5 d后檢測隨機鼠尾末梢血糖≥16.67 mmol/L為成模，篩選血糖穩定在26～32 mmol/L達2周者留做實驗。實驗小鼠分兩組，第1組小鼠(42只)的兩側股部肌肉各注射質粒 prtTA -tet-INS 150 μg(總計300 μg)，轉染后立即喂濃度為2 mg/mL Dox水(簡稱Dox組);第2組小鼠(35只)的兩側股部肌肉各注射質粒prtTA-tet-INS 150 μg(總計 300 μg)，轉染后飲用水中無Dox(簡稱no Dox組)。第1、2組質粒注射后5 min內在注射部位兩側與注射平行方向插入兩根電極針(直徑0.2 mm，長度1.5 cm，兩針間距0.5 cm)并將其與轉基因儀連接，給予方波電脈沖刺激(電壓200 V/cm，波寬 40 ms，脈沖次數 6 和頻率 1 Hz)［5，6］。兩組轉染后監測鼠尾末梢血糖。

1.2.3 動物標本的留取及檢測:轉染第14天，各組各取3～4只小鼠，摘眼球取血，分離血清，保存于-20℃冰箱中;留取兩股肌肉、肝臟組織，保存于液氮中。

1.2.4 小鼠血清人胰島素:按廠家提供說明書ELISA法檢測小鼠血清人胰島素。

1.2.5 小鼠肌肉組織中人胰島素原基因mRNA的提取及RT-PCR檢測:按廠家提供的方法用Trizol試劑提取肌肉、肝臟組織mRNA。以小鼠β-actin為內參，上游引物:5＇- AGCCTTCCTTCTTGGGTATG -3＇，下游引物:5＇- AACGCAGCTCAGTAACAGTC -3＇，擴增片段長度為364 bp。根據質粒prTA-tet4-rhINS的rhINS片段設計引物，上游引物:5＇-CGCAGCCTTTGTCAACCAAC -3＇，下游 引 物:5＇- CACAATGCCACGCTTCTGTC -3＇，擴增片段長度為217 bp。RT -PCR反應條件:30℃，10 min;42℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min;1個循環。PCR反應條件:94℃，2 min;1個循環;94 ℃，30 s;55 ℃，30 s;72 ℃，1 min;共35個循環。

1.3 統計學方法

采用SPSS10.0統計軟件進行統計學處理，結果以±s表示，t檢驗進行組間均值比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人胰島素原基因在小鼠肌肉組織中的表達

Dox組與no Dox組轉移后通過RT-PCR在肌肉組織均得到預期的217 bp人胰島素原基因mRNA條帶，且前者在亮度上顯著強于后者(圖1A)，證實載有Tet-on系統的人胰島素原基因經Dox調控后在小鼠肌肉組織中具有較高水平的mRNA表達，當無Dox調控時，同樣可以檢測出較低水平的表達。而兩組肝臟組織的RT-PCR未擴增出特異條帶(圖1A)。

圖1 人胰島素原基因在小鼠肌肉組織中的表達Fig 1 mRNA RT-PCR results

2.2 兩組小鼠血清人胰島素比較

Dox組轉移prTA-tet4-rhINS質粒之后糖尿病小鼠血清中人胰島素水平明顯增高，為(55.67±1.366)μIU/L，no Dox組也可檢測到糖尿病小鼠血清胰島素，但水平較低(16.3 ±0.577)μIU/L，兩組比較差異有顯著性意義，P＜0.01。

2.3 強力霉素對prTA-tet4-rhINS基因表達的調控

電穿孔轉移人胰島素原基因后，no Dox組雖然血清中可檢測到人胰島素，但并無明顯降糖作用，電轉移24 h后，Dox組與no Dox組小鼠的血糖比較差異有顯著性意義，P＜0.05，可實現較為明顯的降糖效果;撤除Dox組飲用水中的Dox后，糖尿病小鼠體內血糖開始升高，于48 h后升至治療前血糖水平，此時兩組比較血糖差異無顯著性意義，P＞0.05;再次給入Dox，血糖水平逐漸下降，并于72 h內達到撤藥前水平，Dox組與no Dox組小鼠的血糖比較差異有顯著性意義，P＜0.05。見圖2。

3 討 論

圖2 兩組糖尿病小鼠電轉后血糖水平及調控作用Fig 2 Comparison of the hypoglycemic effect in the Dox and no Dox group and tetracycline regulation on human proinsulin expression

鑒于生理情況下，胰島素的分泌是受葡萄糖調節感受器調控的，而導入體內的胰島素基因的持續表達勢必會存在低血糖的危險，故胰島素基因的調控表達則成為基因治療的關鍵，本研究從此方面進行了探索。

四環素調控系統是一種反式作用因子調控模式，于1992年首先由Gossen和Bujard構建成功。反式作用因子tTA/rtTA為一融合蛋白，兩者僅相差4個氨基酸，分別組成四環素調控系統的兩種形式:tetoff和tet-on系統。tet-on系統中，四環素的存在使rtTA發生構象變化，從而與四環素啟動子(Ptet)中的四環素操縱子(tetO)相結合使轉錄發生;而在tet-off系統中，加入四環素則使tTA與 Ptet分離，從而使轉錄中斷。本實驗采用的是tet-on系統，通過加入/撤除強力霉素(四環素的衍生物)，rtTA2-1特異、可逆地與Ptet結合、分離，從而作為一種轉錄開關調節基因的表達。本實驗中，為增加表達效率，在Ptet與Ph-CMV兩啟動子之間插入一段3.3 kbp序列，以使兩者互不干擾發揮最大作用。

四環素調控系統的突出特點為:可產生階梯式、漸進性調控。另外，它來源于原核生物，不干擾真核生物基因組的表達，同時其誘導物強力霉素(Dox)劑量相當于其毒性劑量的1/300，故較為安全。目前，四環素調控系統已成功調控了多種基因的表達［7-9］，其安全、高效的特點已得到公認。

本實驗證實載有Tet-on系統的人胰島素原基因經強力霉素(Dox)調控后在小鼠肌肉組織中具有較高水平的mRNA表達。當無Dox調控時，同樣可以檢測出較低水平的表達，說明該系統存在背景表達。而兩組肝臟組織的RT-PCR未擴增出特異條帶，說明人胰島素原基因僅在注射部位的肌肉組織中特異表達。本實驗通過轉染載有Tet-on系統的人胰島素原基因實現了該基因的表達，通過飲用水中加入Dox，獲得了較為理想的降糖效果，同時撤除Dox后，糖尿病小鼠體內血糖開始升高，于48 h后升至治療前血糖水平，再次給入Dox，血糖水平逐漸下降，并于72 h內達到撤藥前水平。如此重復加入/撤除兩次均能實現對質粒prTA-tet4-rhINS的表達開關，從而達到安全調控的目的。而飲用水中未加入調控誘導劑Dox時，在肌肉組織中可以檢測到較低水平的人胰島素基因mRNA水平表達，且血清中可檢測到較低水平的人胰島素，但此胰島素水平并不能使糖尿病小鼠血糖降低，據此可推斷，Teton系統對于調控基因的背景表達或許可為糖尿病小鼠提供較為安全平穩的基礎胰島素分泌，這恰恰為胰島素基因治療糖尿病要求非進餐時體內存在低水平的基礎胰島素，而餐后較高水平表達控制餐后血糖所需要的，但應該看到本研究Dox調控雖然可以通過給藥與撤除強力霉素實現對prTA-tet4-rhINS質粒的表達開關，從而使血糖隨其升降，但胰島素基因表達以及血糖的升降滯后于給藥撤藥的時間過長，如何實現該基因體內表達的瞬時調控需進一步深入研究。

本實驗在胰島素基因治療的調控方面做一嘗試，結果表明強力霉素調控的胰島素基因可實現糖尿病小鼠體內穩定的表達，產生明顯的降糖效果，且僅通過飲用水中誘導劑的加入撤除，即可實現該基因的開關表達，重復性好，操作簡便、安全，為分泌蛋白的人為體內調控的可行性提供了依據。

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Regulated human proinsulin expression in vivo using Tet-inducible vectors

LIU Hai- xia，LI Hong，SU Ben - li
(Department of Endocrinology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China)

Abstract:［Objective］To evaluate the hypoglycemic effect of a doxycycline regulated insulin expression vector electroporated to skeletal muscle of streptozotocin-induced diabetic mice.［Methods］The plasmid prTA -tet4-rhINS constructed previously was transferred to hindleg muscle of streptozotocin - induced diabetic mice of Kunming species，and fed in the drinking water with doxycycline immediately.The tail blood glucose was measured with glucose oxidase method daily.Human true insulin was analyzed with ELISA.Total mRNA were extracted from muscles and liver tissues.RT - PCR was used to analyze the human proinsulin mRNA levels.［Results］Following intramuscular injection of the vector，the insulin mRNA expressions in mice muscles were examined and repeated induction of serum insulin protrein following doxycycline administration were observed.The best hypoglycemic effect was showed in second week after transfer，with withdrawal of inducer doxycycline，blood glucose began to increase to the level before transfer in 48 hours;and then with doxycycline administration，blood glucose of the mice decreased to the level gradully before withdrawal in 72 hours.Two cycles of regulation with the same results were achieved over 34 days.［Conclusion］The tet- on system is a useful tool for controlling the expression of human insulin electropotated in mice.

Key words:tetracycline regulatory system;insulin;diabetes mellitus;gene therapy

Q78

A

1671-7295(2011)05-0444-04

2011-04-14;

2011-05-29

劉海霞(1977-)，女，黑龍江雞西人，主治醫師，博士研究生。E-mail:dllhx1017@163.com

蘇本利，教授。E-mail:dlbenlisu@sina.com