順鉑體內注射對子代豚鼠耳蝸毛細胞的影響

郝 帥，閆艾慧，姜學鈞

(中國醫科大學 第一臨床醫院 耳鼻咽喉科，遼寧 沈陽 110001)

順鉑以其廣譜高效性在抗腫瘤治療中被普遍應用，但其腎毒性和耳毒性的副作用使得目前臨床應用被嚴格控制[1]，特別是順鉑可造成聽功能永久性損傷[2]。本研究組前期實驗發現孕晚期順鉑暴露致子代豚鼠毛細胞損傷及聽力下降，但孕期順鉑暴露致子代出生后毛細胞損傷的研究未見報道。因此，本實驗通過檢測順鉑能否誘導毛細胞凋亡，為順鉑耳毒性研究及其防護提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

順鉑注射劑為齊魯制藥產品，兔抗Caspase-3多克隆抗體為美國Cell Signalling Techenology公司產品，TUNEL試劑盒為美國BD Biosciences公司產品；冰凍切片機位德國SLEE公司產品，光學顯微鏡為日本Olympus光學工業產品。

1.2 實驗動物

健康白色紅目受孕豚鼠12只(體重600～700 g)，中國醫科大學動物部提供。雙側耳廓反射靈敏，在安靜的環境下飼養。實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2003-0009；使用許可證號：SYXK(遼)2003-0013。

1.3 動物分組與處理

隨機分成兩組，每組6只，從孕50 d至56 d連續腹膜內注射：(1)對照組：生理鹽水1.5 mg/kg·d；(2)順鉑組：順鉑1.5 mg/kg·d。子代出生后14 d，分離仔鼠右側耳蝸，行TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色。

1.4 耳蝸冰凍切片制備

快速打開胸腔，左心室穿刺，接灌流液，右心耳剪開。先以4℃生理鹽水經心臟灌流，待右心耳處流出液體為無色時，改以4℃新鮮配置的4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.4)約300 mL灌流固定。快速斷頭，取雙側聽泡4%多聚甲醛溶液固定24 h，10%甲酸-甲酸鈉常溫脫鈣1周。30%蔗糖4℃過夜，聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物冰凍切片包埋劑包埋，恒冷箱切片機沿蝸軸平行方向行10 μm厚連續切片。

1.5 Caspase-3免疫組化檢測

冰凍切片干燥及過氧化物酶阻斷后，室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min，3次。滴加山羊血清封閉，室溫孵育50 min，滴加一抗，4℃過夜。PBS沖洗5 min，3次。滴加生物素標記二抗，室溫孵育50 min。PBS沖洗5 min，3次。滴加鏈霉素親和素過氧化物酶溶液，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次。DAB顯色，蘇木素復染，常規酒精梯度脫水，二甲苯透明，甘油封片。在400倍光鏡下行細胞計數，做到計數區域相同。將每個標本共3個視野的陽性細胞數取平均值，做為該標本的陽性細胞數，所得數據進行統計學處理。

1.6 TUNEL染色

冰凍切片干燥及過氧化物酶阻斷后，室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min，3次。0.1 mol/L TBS 1∶100新鮮稀釋蛋白酶K 37℃消化10 min，按每張切片取末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)和DIG-d-UTP各1 μL，加10 μL抗體稀釋液，每片加標記液20 μL，濕盒37℃孵育2 h，PBS沖洗5 min，3次。滴加封閉液，每片50 μL，室溫孵育50 min，PBS沖洗5 min，3次。用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，每片50 μL，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次。DAB顯色，蘇木素復染，常規酒精梯度脫水，二甲苯透明，甘油封片。光鏡下觀察TUNEL陽性反應細胞并計數和統計。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 順鉑對豚鼠母體生殖指標及仔鼠體重的影響

兩組在母體生殖指標和子代體重間比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。見表1。

表1 母體生殖指標和子代體重比較

2.2 順鉑對子代豚鼠Caspase-3在耳蝸毛細胞表達的影響

順鉑組子代豚鼠出生后14 d，在耳蝸毛細胞可見棕黃色顆粒(A，黑色箭頭)，Caspase-3陽性染色明顯；對照組陽性染色不明顯(B)。見圖1。

2.3 順鉑對子代豚鼠耳蝸毛細凋亡的影響

順鉑組(A)子代豚鼠出生后14 d，耳蝸部分毛細胞核呈棕褐色染色，大小不一，形態不規整且排列紊亂，呈明顯凋亡；對照組(B)核內無棕褐色著染,形態規整,排列整齊,陽性染色不明顯。見圖2。

3 討 論

順鉑造成聽功能損傷的副作用已得到廣泛證實，順鉑耳毒性損傷機制可通過多種途徑表現，即直接損傷內耳蓄積、影響內耳代謝、改變血清電解質平衡及氧化應激損傷等[3]。本研究采用低劑量孕晚期給藥，借以模擬人群病理狀態。哺乳動物孕期毛細胞的正常分化，對其成熟后聽功能建立非常重要[4]。順鉑暴露可造成機體內分泌系統紊亂，從而導致機體生理狀況改變[5]。但本研究結果顯示，順鉑并未影響豚鼠母體產子數和子代體重，這可能與給藥劑量、方式及給藥持續時間有關。本研究所采用劑量為1.5 mg/kg·d，孕晚期連續7 d給藥，該劑量及給藥方式不會在動物實驗中引起明顯聽力損傷[6]，而且在停藥4周后外毛細胞可有部分恢復[7]，耳蝸功能在8周后可恢復[8]。由此證明，本研究所采用順鉑劑量對母鼠是可代償的。

圖1 子代豚鼠毛細胞Caspase-3表達(免疫組化染色 400×)

圖2 子代豚鼠耳蝸毛細胞凋亡(TUNEL染色 400×)

但本研究發現，順鉑可經胎盤誘導子代豚鼠耳蝸毛細胞凋亡發生。TUNEL染色是對完整的凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，通過檢測細胞凋亡的啟動階段，由細胞內內源性核酸內切酶激活所造成的DNA片段的3’羥基末端，確定細胞凋亡的發生，用以反映細胞凋亡典型的生物化學和形態學特征[9]。Caspase-3是Fas通道細胞凋亡蛋白級聯反應中的核心蛋白，在凋亡的啟動過程中發揮重要作用，被認為是最重要的執行者，它由上游的Caspase(Caspase-8、Caspase-9或Caspase-10)激活并水解為活性酶形式，Caspase-3特異性地激活核酸內切酶，后者被釋放出來，隨后引起DNA迅速片段化[10]，對細胞凋亡是必需條件。抑制Caspase-3酶活性或拮抗Caspase-3功能可使細胞凋亡受抑。本研究結果顯示，順鉑暴露誘導子代豚鼠Caspase-3在耳蝸毛細胞表達增加。由此提示，順鉑可經胎盤損傷子代耳蝸毛細胞發育，可能是通過觸發Caspase-3參與的級聯效應，繼而活化引起子代毛細胞形態上的改變，從而促進凋亡完成。

參考文獻：

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