hMSH2、MGMT在子宮內膜癌中的表達及其病理意義

李斯寧，李 玲，王長智

(1.大連醫科大學 附屬第二醫院 婦產科，遼寧 大連116027；2.大連醫科大學 附屬第二醫院 實驗中心，遼寧 大連 116027)

子宮內膜癌(endometrial carcinoma，EC)，又稱子宮體癌，是女性生殖系統常見的三大惡性腫瘤之一，占女性生殖系統惡性腫瘤的20%～30%。近年來，其發病率呈明顯上升趨勢[1]。作為不穩定細胞，子宮內膜細胞周期性的脫落與增殖，伴隨DNA復制，與穩定細胞以及永久性細胞相比，其基因損傷的幾率較高。因此，子宮內膜細胞在復制過程中具有較高的修復依賴性。若基因發生損傷，修復系統則發揮其作用，維持基因的穩定性。當基因損傷無法修復時，基因突變產生，突變產物的累積是腫瘤發生的原因之一。在人體內存在多種基因修復方式，DNA復制過程中發生不同類型的損傷都會有相應的修復系統來修復這種損傷，即修復的種類可提示DNA損傷的類型。p53是研究最為廣泛的抑癌基因，其突變是多種腫瘤發生的主要原因。p53的突變是目前對子宮內膜癌的研究中已明確的分子生物學改變[2]。由于野生型的P53蛋白半衰期較短，因此，目前認為通過免疫組織化學方法可以檢測出的P53蛋白大多是突變型的p53。突變型p53失去了對腫瘤的抑制作用，反而促進細胞的惡性轉化。因此，以已知的p53突變為指標，通過檢測不同種類的修復方式所表達的蛋白與突變型p53的關系，推測導致p53突變的原因。hMSH2蛋白是錯配修復蛋白的主要成員[3]。當細胞中的基因錯配增加時，hMSH2蛋白的表達將反饋性增高。MGMT蛋白則具有中和修復DNA烷化損傷的作用[4]。當DNA出現烷化損傷時，MGMT蛋白表達上調。本研究用免疫組織化學法檢測正常子宮內膜與子宮內膜癌組織中的hMSH2、MGMT兩種修復蛋白的表達，通過分析二者表達與p53表達的關系，探討子宮內膜癌的發生機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取大連醫科大學附屬第二醫院2007～2009年期間診斷明確的子宮內膜癌手術切除標本66例。其中，子宮內膜樣腺癌62例，其他類型4例；病理分級I級30例，II級24例，III級12例；無淋巴轉移53例，有淋巴轉移13例；淺肌層浸潤50例，深肌層浸潤16例。所有病例均未經放療、化療和性激素治療。正常子宮內膜組織選取自大連醫科大學附屬第二醫院，其中包括分泌期與增生期子宮內膜。

1.2 主要試劑

鼠抗人hMSH2單克隆抗體：Zymed公司(美國)；兔抗人p53單克隆抗體： Santa Cruz公司(美國)；鼠抗人MGMT單克隆抗體：北京中山試劑公司；SP試劑盒和DAB顯色劑：北京中山試劑公司。

1.3 實驗方法

(1)石蠟切片脫蠟至水；(2)蒸餾水沖洗，3%H2O2室溫孵育；(3)pH6.0檸檬酸緩沖液行抗原修復；(4)加一抗 4℃過夜；(5)加二抗 37℃孵育；(6)加入辣根過氧化物酶；(7)DAB顯色，蘇木素復染，封片。PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定

hMSH2蛋白陽性表達為細胞核、細胞質或兩者均出現棕黃色顆粒，計數5個高倍鏡視野或500個細胞，按照染色強度計分：無色記為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞所占百分比計分：陰性為0分，陽性細胞占10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度與陽性細胞所占百分比的乘積≥3分為陽性，<3分為陰性[5]。MGMT蛋白陽性細胞染色為細胞質出現棕黃色顆粒，P53陽性細胞染色為細胞核出現棕黃色顆粒，陽性率(陽性細胞數與腫瘤細胞總數之比)≥20%為陽性表達，<20%為陰性。

1.5 統計學方法

實驗結果應用SPSS17.0軟件包分析，采用χ2檢驗和四格表確切概率法處理數據，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hMSH2 、MGMT及P53在子宮內膜癌和正常子宮內膜組織的表達

hMSH2、MGMT 、P53在子宮內膜癌中表達的陽性率均明顯高于正常子宮內膜組織，差異有顯著性意義(P<0.05)(表1)。三者在子宮內膜癌中的陽性表達分別見圖1～3。

2.2 P53蛋白的表達與子宮內膜癌的病理分級、淋巴轉移以及浸潤深度之間的關系

P53蛋白的陽性表達率在不同病理分級的子宮內膜癌中差異有顯著性意義(P<0.05)，Ⅰ～Ⅱ級的陽性表達率為35.2%，而Ⅲ級的陽性表達率為83.3%；有無淋巴結轉移組間陽性表達率的差異無顯著性意義(P>0.05)；淺肌層浸潤組陽性表達率明顯低于深肌層浸潤組(P<0.05)(表2)。

2.3 子宮內膜癌中P53蛋白的陽性表達率與hMSH2、MGMT陽性表達率之間的關系

子宮內膜癌中，hMSH2蛋白在P53陽性組的表達率為96.6%，與陰性組的70.3%比較差異有顯著性意義，P53蛋白與hMSH2蛋白表達呈正相關(χ2=7.548，P<0.05)；MGMT蛋白在P53陽性組的表達率為65.5%,與陰性組的75.7%比較差異無顯著性意義，P53蛋白與MGMT蛋白表達無明顯相關性(P>0.05)(表3)。

表1 hMSH2、MGMT 、P53在子宮內膜癌與正常子宮內膜中的陽性表達率

圖1 P53蛋白在子宮內膜癌的陽性表達(SP 400×)

圖2 hMSH2蛋白在子宮內膜癌的陽性表達(SP 400×)

圖3 MGMT蛋白在子宮內膜癌的陽性表達(SP 400×)

表2 P53在不同病理分級、有否淋巴轉移、不同浸潤深度的子宮內膜癌中的陽性表達率

表3 子宮內膜癌中P53蛋白的陽性表達率與hMSH2、MGMT陽性表達率之間的關系

3 討 論

子宮內膜癌組織學上多數為腺癌。雖然其病因尚不明確，但多數研究認為與持續雌激素刺激和遺傳等因素有關。同其他惡性腫瘤一樣，子宮內膜癌的發生也是一個包括癌基因激活、抑癌基因突變與失活等多因素參與的漸進過程。由于子宮內膜細胞是不穩定細胞，其DNA復制較其他細胞活躍，在復制過程中發生損傷的機會較高，相應的修復系統功能正常對維持基因組穩定性十分重要。本研究探討了子宮內膜癌發生過程中DNA修復基因hMSH2和MGMT的表達對抑癌基因p53突變的影響，期望對子宮內膜癌發生機制的研究有所幫助。

目前，有研究認為p53是潛在的腫瘤診斷標志物。p53基因分為野生型和突變型。野生型p53基因是一種抑癌基因,它的失活對腫瘤形成起重要作用，p53是一個重要的抗癌基因，它促使癌細胞凋亡,防止癌變,還具有幫助細胞基因修復缺陷的功能。這種功能對于受化療藥物作用而受傷的癌細胞,則起修復作用,而不是使癌細胞凋亡,造成被修復的癌細胞在治療后容易產生新的變異進而導致新的腫瘤產生[6]。因此，p53基因突變后不僅失去正常抑癌作用,還可促進細胞惡性轉化[7]。hMSH2基因是第1個被分離出來的人類錯配修復基因，其編碼的蛋白具有識別并參與堿基錯配修復的功能，從而能夠維持基因組的穩定性[8]。Leach等[9]在對散發性腫瘤(如膀朧上皮惡性腫瘤)的研究中發現hMSH2蛋白的表達常表現為異常升高。董莉等[10]也在實驗中發現hMSH2在子宮內膜癌中出現這種高表達的現象，與本實驗結果相一致。這可能是癌細胞增殖較正常細胞活躍，DNA發生錯配幾率增高，hMSH2的表達代償性增高的結果。MGMT是一種修復基因，其表達的蛋白產物主要是修復由烷化劑導致的DNA損傷。正常情況下MGMT可將DNA鏈中烷基移到自身半胱氨酸的殘基上，從而修復烷化劑導致的DNA損傷[11]。許多學者研究表明，惡性腫瘤中的MGMT均有表達[11-13]，而本實驗中MGMT蛋白表達率在子宮內膜癌組也顯著高于正常子宮內膜組，可能由于細胞發生過多的甲基化損傷而導致癌變，這些損傷需要MGMT表達上調來修復。因而甲基化損傷可能是子宮內膜癌發生的一個原因。本實驗結果顯示P53蛋白、hMSH2蛋白和MGMT蛋白表達率在子宮內膜癌組均顯著高于正常子宮內膜組，提示P53蛋白可作為子宮內膜癌變的標志物之一；聯合檢測P53、hMSH2和MGMT蛋白可能有助于子宮內膜癌的診斷。

本研究還發現病理分級為Ⅲ級的子宮內膜癌P53蛋白表達率顯著高于Ⅰ～Ⅱ級內膜癌，在深肌層浸潤組明顯高于淺肌層浸潤組。許多學者分析，高度惡性的子宮內膜癌與低度惡性子宮內膜癌P53表達有明顯差異，P53蛋白表達的量可作為良惡性程度判斷的指標之一[14]。提示P53蛋白的陽性表達可視為惡性腫瘤的信號，p53突變的原因一直是探討基因突變與腫瘤發生相關性的重要問題，本實驗通過檢測P53蛋白陽性組與陰性組中修復基因的表達差異來反應DNA損傷情況，從而推測突變發生的原因。

本研究檢測發現hMSH2蛋白在P53陽性組的表達率顯著高于陰性組。子宮內膜癌中的P53表達與hMSH2蛋白的表達呈顯著正相關，即P53表達高的組中hMSH2也高表達。MGMT蛋白在P53陽性組的表達率與陰性組比較差異無顯著性意義，P53蛋白與MGMT蛋白表達無明顯相關性。存在p53突變的子宮內膜癌組織中hMSH2蛋白表達較高，說明突變過程中存在大量的DNA錯配， hMSH2蛋白針對p53基因突變中的錯配反應性表達上調，以修復受損基因。由此可見，在p53的突變過程中基因錯配累積可能是其發生的原因之一。子宮內膜癌發生的根本原因之一可能是由于基因錯配累積所引起。

hMSH2、MGMT、p53在子宮內膜癌的發生、發展中可能起著一定的作用，聯合檢測P53與hMSH2蛋白也可為子宮內膜癌的診斷和預后評估提供重要線索。在子宮內膜癌發生過程中p53突變的原因可能是惡性轉化細胞的DNA錯配。

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