非小細胞肺癌中Kras與Braf蛋白的表達及其意義

韋 鴻，呂海辰，李 梅，馮 璐，王朝暉，呂 申

(1.大連醫科大學 附屬第二醫院 實驗中心，遼寧 大連 116027；2.復旦大學 上海醫學院 臨床醫學07級8年制，上海 200032)

肺癌是影響人類生存的重大疾病之一。每年死于肺癌的人數占癌癥死亡總數的17.8%[1]，其中大約80%為非小細胞肺癌。近年來，分子靶向藥物酪氨酸激酶受體抑制劑TKI(tyrosine kinase inhibitor)治療肺癌的臨床成績已得到廣泛關注。該藥的作用機制為通過抑制EGFR(epidermal growth factor receptor)酪氨酸磷酸化，阻止EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信號轉導通路的啟動，抑制腫瘤細胞生長。臨床研究發現，TKI僅對腫瘤細胞EGFR外顯子有突變的肺癌患者治療有效。然而，仍有一些患者的腫瘤細胞雖有EGFR外顯子突變，但對TKI的治療并不敏感，其原因被認為是該轉導系統的下游信號因子Kras或Braf異常激活造成腫瘤細胞持續增殖[2,3]。據報道，在非小細胞肺癌患者中常有Kras和Braf的突變[4]。提示在篩選TKI治療敏感的肺癌患者時，應聯合檢測EGFR、Kras和Braf的突變情況。一般認為，基因的突變常與蛋白異常表達相關。迄今，非小細胞肺癌細胞的Kras及Braf蛋白表達狀況及其與肺癌臨床病理參數間的關系尚不明確。本研究用免疫組化方法檢測非小細胞肺癌的Kras及Braf蛋白表達狀況，分析其與臨床病理學參數之間的關系，期望對篩選TKI治療敏感的人群提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2007～2009年大連醫科大學附屬第一、第二醫院及其他幾家醫院非小細胞肺癌標本126例。其中，男性71例，女性55例；年齡36～80歲，平均(61.85±8.96)歲，≤62歲66例，>62歲60例；吸煙42例，不吸煙84例；淋巴結轉移64例，無淋巴結轉移62例；腺癌85例，其中高中分化53例，低分化32例；鱗癌36例，其中高中分化20例，低分化16例；腺鱗癌5例，其中高中分化1例，低分化4例。選其中26例癌旁組織作為對照。

1.2 研究方法與判斷標準

1.2.1 免疫組織化學方法：Kras與Braf蛋白檢測均采用免疫組化SP法，操作步驟按照試劑盒說明進行，微波修復、DAB顯色、沖洗、蘇木素復染、封片。取已知陽性組織作陽性對照，以PBS替代一抗作陰性對照。

1.2.2 判斷標準：在高倍顯微鏡下隨機選取5個高倍視野，依陽性細胞百分比做半定量分析。陽性細胞百分比≤25 %記為1分、25 %～50 %記為2分、51 %～75 %記為3分、>75 %為4分；細胞漿無色記為0分、淡黃色記為1分、棕黃色記為2分、棕褐色記為3分；最后將二者相乘，積分≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS統計軟件進行Chi-square檢驗和Spearman相關分析，結果均以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 Kras和Braf蛋白在肺癌組織和癌旁組織的表達情況

Kras蛋白陽性表達率在肺癌組與癌旁組分別為40.5%(51/126)與42.3%(11/26)，兩者間差異無顯著性意義(P>0.05)；Braf蛋白陽性表達率在肺癌組與癌旁組分別為26.2%(33/126)與26.9%(7/26)，兩者間的差異亦無顯著性意義(P>0.05)。

2.2 Kras及Braf蛋白分別在同一病例癌與癌旁組織表達的相關性

Kras蛋白在同一病例癌與癌旁組織間的表達顯著相關(r=0.456,P<0.05)；Braf蛋白在同病例癌與癌旁組織間的表達不相關(r=0.079,P>0.05)。見表1。

表1 Kras及Braf蛋白分別在同病例癌與癌旁組織表達的相關性

2.3 肺癌組織Kras及Braf蛋白表達與患者臨床病理學參數之間的關系

Kras蛋白表達與肺癌患者的性別、年齡、吸煙與否、淋巴結轉移以及腫瘤組織學類型和分化程度無關(P>0.05)；Braf蛋白表達與患者吸煙及淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)。Braf蛋白陽性表達率在吸煙與不吸煙患者分別為11.9%(5/42)與33.3%(28/84)，兩者間的差異有顯著性意義(P<0.05)；在淋巴結轉移與無淋巴結轉移患者分別為14.1%(9/64)與38.7%(24/62),兩者間的差異有顯著性意義(P<0.05)。Braf蛋白表達與患者的性別、年齡及腫瘤組織學類型和分化程度無關(P>0.05)。另外，本實驗將同一例肺癌標本中無論是僅出現Kras蛋白陽性表達或僅出現Braf蛋白陽性表達均記為該標本蛋白陽性表達，結果顯示蛋白表達與患者的性別、年齡、吸煙與否、淋巴結轉移以及腫瘤組織學類型和分化程度均無關(P>0.05)。見表2。

表2 肺癌組織Kras及Braf蛋白的表達與臨床病理學參數之間的關系

2.4 肺癌組織Kras與Braf蛋白表達的相關性

經相關性檢驗，在肺癌組織中Kras與Braf蛋白間的表達不相關(r=0.024,P>0.05)。

3 討 論

非小細胞肺癌的發生發展是一個多因素調控的過程，有多種基因參與腫瘤細胞的增生、分化和凋亡。Kras基因編碼21 kDa鳥苷酸結合蛋白，有三種密切相關的Ras蛋白，即Krast、Hrast、Nras構成小分子GTP酶的Ras超家族成員，它們可以作為分子開關，傳遞細胞外信號從而引發一系列基本的細胞過程，包括增殖、存活和分化[5,6]。當前Ras蛋白的生化模型提示，Ras以GDP結合的非活化形式存在，當與GTP結合則被啟動，Kras的啟動將進一步激活Ras-Raf-MEK-ERK這條信號通路，導致細胞的異常增生，促使腫瘤形成。本實驗通過對Kras蛋白表達的研究發現，雖然Kras蛋白在非小細胞肺癌的癌組織與癌旁組織間表達的差異無顯著性意義，但在同病例的癌與癌旁組織間的表達呈正相關，即在癌組織有Kras蛋白表達的病例，其癌旁組織也有該蛋白的表達。一方面，Kras蛋白的表達狀況可能與患者間的個體差異有關；另一方面，也提示肺組織在腫瘤細胞形成之前已經有Kras蛋白表達，Kras蛋白在非小細胞肺癌發生及演進中的作用及臨床意義值得進一步探討。另外，基因突變常會導致蛋白的異常表達。有關研究表明，有Kras突變的非小細胞肺癌患者對TKI治療不敏感，那么Kras蛋白異常表達是否也會影響TKI療效還需要深入研究，這將對TKI治療的敏感人群篩選提供幫助。

圖1 A：肺腺癌Kras蛋白陽性表達(SP 200×)；B：肺腺癌Kras蛋白陰性表達(SP 200×)；C：肺腺癌Braf蛋白陽性表達(SP 200×)；D：肺腺癌Braf蛋白陰性表達(SP 200×)

Braf基因是1988年由Ikawa等首先在人類尤文肉瘤中發現并克隆確認的，一種能轉染NIH3T3細胞且有活性的DNA序列，因其與Craf和Araf有相當高的同源性，故稱其為Braf。Braf是Ras-Raf-MEK-ERK信號轉導通路重要的轉導因子，它主要通過有絲蛋白激酶通路中的絲/蘇氨酸蛋白激酶來發揮作用，該酶將細胞表面的受體和Ras蛋白通過MEK和ERK與核內的轉錄因子相連接，啟動多種因子參與調控細胞內多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等[7]。本研究發現，Braf蛋白在非小細胞肺癌患者的癌組織與癌旁組織間表達的差異無顯著性意義，在同一病例癌與癌旁組織間的表達也不相關,但Braf蛋白的表達與患者吸煙與否顯著相關，不吸煙患者Braf蛋白的表達顯著高于吸煙患者。蛋白的異常表達常與突變相關，但有報道稱在不吸煙肺癌患者中并沒有檢測到Braf突變[8]，且不吸煙患者對TKI的治療敏感，這提示在不吸煙非小細胞肺癌患者中即使Braf蛋白高表達，Braf也可能會無突變，并且此類患者可能會對TKI的治療敏感。本研究還發現，無淋巴結轉移患者Braf蛋白表達顯著高于有淋巴結轉移患者，這提示Braf蛋白表達狀況可能會指示腫瘤細胞的惡性程度，即Braf蛋白表達越高，該腫瘤細胞惡性程度越低。對Kras與Braf蛋白表達的相關性研究發現二者之間的表達不相關，這提示了在非小細胞肺癌中Kras與Braf蛋白的異常表達是相互獨立發生的。有關研究表明，在肺癌中Kras與Braf的突變也是相互獨立發生的，且不會同時發生在同一例患者當中[9]。因此，若能將Kras與Braf蛋白的表達與基因突變情況相結合進行深入的研究，可能會對指導應用TKI有一定幫助。

非小細胞肺癌Kras及Braf蛋白在不同患者間的表達狀況不同，對腫瘤的發生及演進有一定影響，通過檢測二者的表達將會對篩選TKI藥物敏感人群有所幫助。

參考文獻：

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