喹硫平對(duì)小鼠腦缺血后膠質(zhì)細(xì)胞增生及炎癥反應(yīng)的作用

房紹寬 吳 江 周春奎

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春 130021)

腦缺血的臨床表現(xiàn)不僅包括運(yùn)動(dòng)、感覺、視覺功能障礙,也包括遺忘、忽略等,而且常伴有情緒紊亂、抑郁焦慮及精神癥狀,這些均抑制腦缺血后生理和認(rèn)知功能的恢復(fù)〔1～4〕。近幾年,有證據(jù)表明一些非典型抗精神失常藥具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究以小鼠腦缺血為模型,研究非典型抗精神病藥喹硫平是否對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用,從而為深入研究非典型抗精神病藥的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制,并對(duì)腦缺血的治療提供有意義的資料,觀察喹硫平對(duì)腦缺血后膠質(zhì)細(xì)胞增生及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇雄性 ICR小鼠(Charles River,St Constant,QC,Canada)46只,實(shí)驗(yàn)開始時(shí)重量 18～20 g,在正常飲食,正常光照時(shí)間,室溫下飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 見表 1,圖 1。

1.3 給藥方法 喹硫平(由英國(guó)Astra Zeneca制藥公司提供)溶于無菌生理鹽水中,參照文獻(xiàn)〔5〕,缺血手術(shù)后給予小鼠喹硫平 10 mg/kg或鹽水腹腔注射處理,1次/d,共 4w。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

1.4 動(dòng)物模型制備 用氯胺酮(110 mg/kg)和甲苯噻嗪(15mg/kg)麻醉,麻醉后沿腹正中線切口,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并用棉線阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流 60 min后撤掉棉線觀察血管血液復(fù)流,然后縫合腹正中線切口。假手術(shù)組執(zhí)行相同程序,但不閉塞雙側(cè)的頸總動(dòng)脈。手術(shù)后用熱毯維持小鼠在正常體溫。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和中性粒細(xì)胞黏附因子(CD11)蛋白質(zhì)表達(dá) 采用鏈霉卵白素-生物素-過氧化物酶(SABC)法,將組織切片置于 3%H2O2中常溫處理 10min;蒸餾水洗滌 3次;加入血清封閉液 5 min;加入一抗(兔抗 GFAP和 CD11特異性抗體)37℃ 1 h;0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌 3次;加入生物素化二抗(羊抗兔IgG)37℃ 10 min;PBS洗 3次;加入 SABC試劑 37℃ 20 min;PBS洗滌 4次;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色;蘇木素輕度復(fù)染,脫水封片鏡檢。

1.5.2 檢測(cè)GFAP-IL-1β共表達(dá) 將組織切片在二甲苯中浸3次,正常山羊血清封閉,分別滴加 50μl的 1∶1混合的兔抗大鼠(1∶100)和小鼠抗大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β(1∶200),設(shè)空白對(duì)照(無一抗,加 PBS)和抗體特異性對(duì)照(加一抗不加二抗,加二抗不加一抗),所有切片同時(shí)染色。切片一抗加入后,置于濕盒內(nèi),4℃,過夜。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)資料以 x±s表示,采用兩因素方差分析比較各組間的差異,應(yīng)用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 缺血組與假手術(shù)組比較腦缺血再灌后 2 h GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化;缺血組與假手術(shù)組相比較腦缺血再灌后 2 d和 4d、8d、2w、4w GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量增加(P＜0.05);喹硫平加缺血組與缺血組比較 2 d、4 d GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化;8 d、2 w、4 w比較 GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。見圖 2。

CD11是活化的小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志,缺血組與假手術(shù)組相比較腦缺血再灌后 2 h,2 d和 4 d CD11陽性細(xì)胞數(shù)量增加(P＜0.05);喹硫平加缺血組與缺血組比較各時(shí)間點(diǎn) CD11陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化。見圖 3。

2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果 缺血組與假手術(shù)組相比較腦缺血再灌后 4 w GFAP-IL-1β共表達(dá)陽性細(xì)胞(黃色)數(shù)量明顯增加(P＜0.01);喹硫平加缺血組與缺血組比較 GFAP-IL-1β共表達(dá)陽性細(xì)胞(黃色)數(shù)量明顯減少(P＜0.01)。見圖 4。

圖2 免疫組化檢測(cè)腦缺血再灌后各時(shí)間點(diǎn)海馬齒狀回區(qū)GFAP表達(dá)的變化

圖3 免疫組化檢測(cè)腦缺血再灌后各時(shí)間點(diǎn)海馬齒狀回區(qū) CD11表達(dá)的變化

圖4 缺血再灌后 4 w GFAP-IL-1β海馬齒狀回區(qū)激光共聚焦顯微鏡觀察(×400)

3 討 論

腦缺血后反應(yīng)性的膠質(zhì)細(xì)胞增生活化包括早期的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和后繼的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持神經(jīng)元正常活性方面發(fā)揮幾項(xiàng)重要作用,包括谷氨酸的攝取、釋放,鉀離子及氫離子的平衡緩沖以及水的轉(zhuǎn)運(yùn)。在正常生理情況下,小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài),分布于整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)。當(dāng)腦部受到損傷或有病原體入侵時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞遷徙到病變部位并發(fā)生一系列結(jié)構(gòu)和功能的變化,發(fā)揮吞噬細(xì)胞的作用。但過度增生活化的膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放有害因子如腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1β、干擾素等導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(DND)。IL-1β可以通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子,使白細(xì)胞聚集在缺血腦組織,引發(fā)炎癥反應(yīng)加重腦組織損害〔6〕。過度增殖的膠質(zhì)細(xì)胞尤其是膠質(zhì)疤痕的形成不僅可影響到神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)、突觸的重建及阻斷腦組織微循環(huán)〔7〕,而且還是腦血管病后癲癇發(fā)病的根源,因此膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的作用具有利弊雙重性。抑制腦缺血后過度的膠質(zhì)細(xì)胞增生及炎癥反應(yīng)成為腦缺血后神經(jīng)功能重建目標(biāo)的重要途徑之一。

非典型抗精神失常藥具有神經(jīng)保護(hù)作用,基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供了非典型抗精神失常藥喹硫平可有效緩解 1-甲基-4苯基吡啶(MPP+)、H2O2及 β淀粉樣肽等由于氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞死亡〔8,9〕。這些神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制包括影響B(tài)ax/Bcl-xl的轉(zhuǎn)位和表達(dá)或 SOD-1的上調(diào)〔10～12〕。先前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明喹硫平能有效緩解慢性應(yīng)激導(dǎo)致的海馬 BDNF和細(xì)胞增生的縮減〔13,14〕,而且喹硫平能有效緩解安非他明所誘導(dǎo)的行為學(xué)改變和對(duì)多巴胺神經(jīng)末梢的毒性作用〔15〕。喹硫平在改善腦缺血后精神癥狀同時(shí)也減輕腦缺血后認(rèn)知功能的損傷〔15〕。

前期的研究中發(fā)現(xiàn)頸總動(dòng)脈閉塞(CCAO)能阻斷 85%的腦血流并足以誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)元損傷而且死亡率僅有 5%,經(jīng)過30、60、90min CCAO模型發(fā)現(xiàn) 60min CCAO在小鼠模型中產(chǎn)生明顯的急性神經(jīng)變性和記憶損傷〔16,17〕。因此本研究中,采用了60 min CCAO模型。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞中絲蛋白的主要組成部分,其表達(dá)量的增加通常被作為星形膠質(zhì)細(xì)胞在 CNS損傷后活化和增殖的標(biāo)志。本文應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)腦缺血及給予喹硫平后海馬齒狀回內(nèi) GFAP陽性細(xì)胞表達(dá),借以分析腦缺血后海馬齒狀回內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖情況及喹硫平對(duì)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。采用激光共聚焦顯微鏡觀察方法評(píng)價(jià)腦缺血后的炎癥反應(yīng)及喹硫平對(duì)腦缺血后炎癥反應(yīng)的作用。本研究顯示腦缺血再灌后2 d,4 d,8 d,2 w和 4w GFAP免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量增加,腦缺血再灌后 8 d,2 w和 4 w喹硫平減少 GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和增生;腦缺血再灌后2h,2d和4 d CD11免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)量增加,喹硫平對(duì)CD11的表達(dá)沒有影響。缺血再灌后 4 w GFAPIL-1β共表達(dá)增加,同時(shí)喹硫平減少 IL-1-GFAP的共表達(dá),從而減輕炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果提示非典型抗精神失常藥物喹硫平能夠減輕腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度增生和活化同時(shí)減輕炎癥反應(yīng)為治療缺血性腦損傷所伴發(fā)的精神紊亂提供新途徑。

1 Chemerinski E,Levine SR.Neuropsychiatric disorders following vascular brain injury〔J〕.Mt Sinai JMed,2006;73(7):1006-14.

2 Desmond DW,Moroney JT,Sano M,et al.Incidence of dementia after ischemic stroke:results of a longitudinal study〔J〕.Stroke,2002;33(9):2254-60.

3 Desmond DW,Moroney JT,Sano M,et al..Mortality in patients with dementia after ischemic stroke〔J〕.Neurology,2002;59(4):537-43.

4 Williams LS,Ghose SS,Swindle RW.Depression and other mental health diagnoses increase mortality risk after ischemic stroke〔J〕.Am J Psychiatry,2004;161(6):1090-5.

5 He J,Xu H,Yang Y,et al.2005.Chronic administration of quetiapine alleviates the anxiety-like behavioural changes induced by a neurotoxic regimen of dl-amphetamine in rats〔J〕.Beha Brain Res,2005;160(1):178-87.

6 Lasser RA,Sunderland T.Newer psychotropic medication use in nursing home residents〔J〕.J Am Geriatr Soc,1998;46(2):202-7.

7 SorensenL,Foldspang A,Gulmann NC,et al.Determinants for the use of psychotropics among nursing home residents〔J〕.Int JGeriatr Psychiatry,2001;16(2):147-54.

8 Wei Z,Bai O,Richardson JS,et al.Olanzapine protects PC12 cells from oxidative stress induced by hydrogen peroxide〔J〕.J Neurosci Res,2003;73(3):364-8.

9 Wei Z,Mousseau DD,Richardson JS,et al.Atypical antipsychotics attenuate neurotoxicity of beta-amyloid(25-35)by modulating Bax and Bcl-X(L/S)expression and localization〔J〕.J Neurosci Res,2003;74(6):942-7.

10 Li XM,Chlan-Fourney J,Juorio AV,et al.Differential effects of olanzapine on the gene expression of superoxide dismutase and the low affinity nerve growth factor receptor〔J〕.JNeurosci Res,1999;56(1):72-5.

11 Qing H,Xu H,Wei Z,et al.The ability of atypical antipsychotic drugs versus haloperidol to protect PC12 cells against MPP+-induced apoptosis〔J〕.Eur J Neurosci,2003;17(8):1563-70.

12 Wei Z,Bai O,Richardson JS,et al.Olanzapine protects PC12 cells from oxidative stress induced by hydrogen peroxide〔J〕.J Neurosci Res,2003;73(3):364-8.

13 Xu H,Chen Z,He J,et al.Synergetic effects of quetiapine and venlafaxine in preventing the chronic restraint stress-induced decrease in cell proliferation and BDNF expression in rat hippocampus〔J〕.Hippocampus,2006;16(6):551-9.

14 Xu H,Qing H,Lu W,et al.Quetiapine attenuates the immobilization stress-induced decrease of brain derived neurotrophic factor expression in rat hippocampus〔J〕.Neurosci Lett,2002;321(1-2):65-8.

15 Nasrallah HA,Tandon R.Efficacy,safety,and tolerability of quetiapine in patients with schizophrenia〔J〕.J Clin Psychiatry,2000;63(13):12-20.

16 Zhang ZG,Bower L,Zhang RL,et al.Three-dimensional measurement of cerebral microvascular plasma perfusion,glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein-2 immunoreactivity after embolic stroke in rats:a double fluorescent labeled laser-scanning confocal microscopic study〔J〕.Brain Res,1999;844(1-2):55-66.

17 Sammon AM.Maize meal,non-esterified linoleic acid,and endemic cancer of the esophagus-preliminary findings〔J〕.Prostaglandins Other Lipid Mediat,1999;57(2):167-71