依達拉奉對大鼠局灶性腦缺血后神經元凋亡的影響

周亞東 楊 琳 李修斌 湯慶賓 夏作理 史繼學

依達拉奉是一種自由基清除劑，其分子結構上具有親脂基團，易到達腦組織，血腦屏障的通透性高達60%，具有自由基清除和抑制脂質過氧化的作用，可以抑制腦細胞(血管內皮細胞和神經細胞)的過氧化損傷，減輕腦缺血引起的腦水腫和組織損害，是一種有效的腦神經保護劑。自問世以來，已被廣泛用于腦梗死的治療，本實驗采用線栓法制備大鼠局灶性大腦中動脈缺血再灌注模型，以探討依達拉奉對腦缺血時神經細胞凋亡的抑制作用及可能機制。

1 材料

1.1 動物與分組 成年雄性Wistar大鼠36只，體重280～320 g，隨機分為假手術(Sham組)組、缺血+生理鹽水對照組(NS組)和腦缺血+依達拉奉干預組(依達拉奉組)。每組12只大鼠，6只動物取腦組織用于MDA、SOD活力的檢測，6只動物行腦組織病理切片用于免疫組化和TUNEL染色，檢測凋亡水平。

1.2 試劑 依達拉奉注射液由先聲藥業股份有公司提供(30 mg/20 ml);TUNEL試劑盒、caspase-3試劑盒購自北京中杉公司。

1.3 儀器 冰凍切片機顯微照相系統超低溫冰箱

2 方法

2.1 模型制作 參照Zea-longa法［1］，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，頸正中切口，在距頸總動脈(CCA)分叉處約5～8 mm處分別結扎頸外動脈(ECA)和頸總動脈(CCA)，并分離結扎頸內動脈(ICA)的分支翼腭動脈，血管夾阻斷ICA的血流，將直徑為0.235 cm的尼龍線，肝素浸泡后經CCA上切口(離分叉處約5～8 mm)，進入CCA、ICA，插入深度約為18～20 mm，絲線扎緊CCA，固定尼龍線，依次關閉切口。術中及術后均注意保溫。缺血2 h后，拔出尼龍線10 mm恢復灌注，假手術組僅結扎頸總、頸外動脈。依達拉奉治療組于術前7 d至術后2 d給予依達拉奉(應用生理鹽水稀釋成濃度1 mg/ml，劑量3 mg/kg)腹腔注入，2次/d。生理鹽水組每日兩次腹腔注射同等劑量的生理鹽水，假手術組不注射藥物。

2.2 標本采集 每組取6只動物于術后48 h用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，剪開胸腔，暴露出心臟，經左心室插管，以生理鹽水向左心室灌注，至右心房流出的沖洗液轉清后，改灌4%多聚甲醛至軀干僵硬時，立即斷頭取腦，于4%多聚甲醛緩沖液24 h，然后進行石蠟包埋切片，用于檢測Caspase-3表達水平及神經細胞凋亡。每組另6只取缺血側腦組織放入4℃生理鹽水，在冰水浴中用玻璃勻漿器制成100 g/L的腦勻漿，用離心機3000r/min，離心15 min，取上清液用于檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。

2.3 MDA含量、SOD活力測定 以四己氧基丙烷為MDA標準品，用硫代巴比妥酸法測定熒光強度，繪制標準曲線。取100 g/L腦組織勻漿液100μl在與標準曲線相同條件下反應，以空白管調零，測定樣品熒光強度，并根據標準曲線計算腦組織MDA含量。SOD活力測定采用改良的黃嘌呤氧化酶法，按試劑盒說明書操作，在550nm處比色。

2.4 免疫組化、細胞凋亡染色并計數 caspase-3蛋白表達檢測采用SP法，抗體及SP試劑盒、DAB試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購于北京中杉公司。免疫組化反應圖像半定量分析:每大腦個標本于視交叉后相應部位連續切片，每隔5張取1張，共取10張切片。每張切片在40倍物鏡下，隨機選取10個視野，測定陽性細胞數，計算每組平均值。

3 結果

3.1 MDA含量、SOD活力 生理鹽水組及依達拉奉治療組大鼠腦組織勻漿中MDA含量較假手術組顯著增高(P＜0.01)，而SOD活力明顯低于假手術組(P＜0.01)，同時依達拉奉治療組腦組織中MDA含量顯著低于生理鹽水組(P＜0.05)，而SOD活力顯著高于生理鹽水組(P＜0.05)，詳見表1。

表1 3組動物腦組織中MDA含量、SOD活力、caspase-3免疫反應陽性細胞數和凋亡細胞數的比較(個/400倍)

3.2 免疫組化 術后48 h梗死灶周圍腦組織可見caspase-3免疫陽性細胞，假手術組也可見少量caspase-3免疫陽性細胞，生理鹽水組caspase-3免疫陽性細胞顯著增多，依達拉奉治療組caspase-3免疫陽性細胞較生理鹽水組顯著減少(P＜0.05)。

3.3 腦組織切片細胞凋亡數測定 TUNEL染色發現凋亡細胞形態學特征示胞體縮小，染色質凝集，密度增高，呈塊狀或顆粒狀，胞核中棕色顆粒。統計結果顯示，假手術組凋亡細胞數(個/40倍物鏡視野)顯著低于生理鹽水組和依達拉奉治療組(P＜0.01)，依達拉奉治療組凋亡細胞數(個/40倍物鏡視野)顯著低于生理鹽水組(P＜0.05)。

4 討論

近年研究證實，氧自由基和活性氧在再灌注損傷中起主要作用。在缺血再灌注損傷過程中氧自由基(OFR)如:超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)等呈爆發性增加［2］，MDA 是脂質過氧化的重要終產物之一，反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度;SOD是機體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶之一，反映了機體清除氧自由基的能力;正常情況下機體內自由基的產生和清除保持著動態平衡，體內SOD活性、MDA含量的變化可以反映機體清除自由基和抗氧化損傷的能力［3］。缺血再灌注時產生的氧自由基可導致脂質過氧化，損傷生物膜(因含脂質雙分子結構)引發脂質過氧化反應從而改變它們的功能，細胞膜通透性增強，線粒體腫脹破裂并誘發細胞凋亡［4］;神經細胞凋亡是腦缺血/再灌注損傷的重要環節，是腦缺血再灌注后遲發性神經細胞死亡(delayed neuronal death，DND)的主要形式［5］，因此如果能阻止凋亡的發展，就有可能減輕腦缺血時腦損傷程度，縮小梗死范圍。現已明確，細胞凋亡的發生是由基因調控的過程，目前認為細胞凋亡是細胞在各種死亡信號刺激后發生的一系列級聯激活的主動性細胞死亡過程。caspase家族在誘導細胞凋亡的分子機制中起著關鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點，是執行凋亡的最終途徑。其中caspase-3被認為是凋亡的關鍵蛋白酶，一旦被激活，即發生下游的級聯反應，使凋亡不可避免，正常情況下，胞質中的caspase-3以無活性的酶原形存在，細胞凋亡信號的出現可導致caspase-3在多種蛋白水解酶的作用下，發生裂解而活化。通過酶解滅活凋亡抑制物、酶解細胞外基質及骨架蛋白、裂解DNA修復相關分子等使細胞解體。因此如能有效抑制caspase-3的活性則可減緩細胞的凋亡。

依達拉奉是一種自由基清除劑，具有自由基清除和抑制脂質過氧化的作用，可以抑制腦細胞(血管內皮細胞和神經細胞)的過氧化作用，本研究旨在探討依達拉奉對大鼠缺血再灌注損傷后細胞凋亡的抑制作用及其機制，結果發現，腦缺血再灌注后大鼠腦組織MDA含量比假手術組顯著升高，SOD活力顯著下降，應用依達拉奉治療后，依達拉奉組比生理鹽水組MDA含量明顯減少，SOD活性明顯回升，這說明依達拉奉有明顯抗脂質過氧化及清除自由基的作用，與文獻報道相符［6］，依達拉奉治療組神經元凋亡數比生理鹽水組顯著下降，同時依達拉奉治療組的caspase-3表達水平比生理鹽水組顯著下降，這說明依達拉奉能明顯抗脂質過氧化并能有效對抗神經元凋亡。

［1］ Longa EZ，Weinstein PK，carison S，et al Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rat.Stroke，1994，265:1883-1889．

［2］ Jain KK.Neuroprotection in cerebrovascular disease.Expert Opin Investig Drugs，2000，9(4):695-711．

［3］ Palmeira CM，Moreno AJ，Madeira VM.Thiol metabolismis altered by t he herbicides paraquat，dinose band 2，4-D:A study in isolated hepatocytes.Toxicol Lett，1995，81:115-123．

［4］ Rizk NN，Rafo ls J，Dunbar JC.Cerebral ischemia induced apoptosis and necrosis in normal and diabetic rats.Brain Res，2006，22(1):204-212．

［5］ Sen S.Programmed cell death:concept，mechanism and control.J Bio l Revcamb Philos Soc，1992，67:287-319．

［6］ Tomatsuri N，Yoshida N，Takagi T，et al.Edaravone，a newly developed radical scavenger，protects against ischemia-reperfusion injury of the small intestine in rats.Int J Mol Med，2004，13(1):105-109.