脂質相關膜蛋白體外誘導hBD-2基因表達的研究

陳 蕓,劉曉健,趙松蘭

(江蘇大學附屬人民醫院婦產科,江蘇鎮江,212000)

近年研究發現,解脲支原體(UU)是女性生殖器感染的重要致病因子,妊娠尤其是晚期妊娠婦女的生理變化有助于UU生長,UU感染可導致胎膜早破(PROM)、早產、胎兒宮內感染、孕婦產褥期感染等。本研究探討 UU感染的致病因素脂質相關膜蛋白(LAMPs)刺激絨毛膜細胞與胎盤滋養細胞產生的hBD-2表達的關系。

1 材料與方法

1.1 凍干UU3標準株

由中心實驗室提供。

1.2 支原體培養

購自珠海麗珠試劑公司。取解脲支原體菌液按1∶10比例接種于固體培養基,在95%CO2、37℃恒溫培養箱中培養,當培養基顏色由玫瑰紅色轉變為橙色(2～4周)后,表示UU已生長至對數期。傳代2～3次后提取其LAMPs。

1.3 LAMPs提取

LAMPs的提取按照有關參考文獻的方法進行。500 mL生長至對數期的UU培養液于無菌離心管中14 000 r/min離心20 min,棄上清,沉渣經PBS洗滌(共洗滌2次),14 000 r/min離心。所得Mg沉渣重懸浮于5 mL含有1 mmol/L EDTA的Tri緩沖鹽液(TBS,50 mmol/L T ris pH 8.0,0.15 mol/L NaCL)當中(TBSE)。隨后加入Triton X-114,使其終濃度為2%,4℃靜置1 h,然后置入37℃水浴箱中孵育10 min使其發生相分離。棄去上層水相,加入等體積TBSE,重復相分離過程1次。第2次相分離結束,棄去水相,再加入等體積TBSE恢復至最初體積。最后加入2.5倍體積無水乙醇,-20℃過夜以沉淀LAMPs。次日于14 000 r/min離心20 min,棄上清,PBS重懸浮LAMPs,超聲處理1～3 min。BCA測定蛋白濃度后置于-80℃備用。LAMPs在使用前用100 μ g/mL多黏菌素B處理 2 h,以去除提取過程中可能存在的內毒素污染。

1.4 實驗標本

取自健康的足月妊娠剖宮產婦女及 UU感染足月妊娠剖宮產婦女各10例,均由江蘇大學附屬人民醫院產科提供。標本采集常規消毒外陰、陰道,以無菌窺器暴露宮頸,以無菌棉球將宮頸揩干凈,再以無菌試子插入宮頸內1～2 cm,旋轉數周后停留半分鐘取出,置培養試管中立即送檢。將采集標本接種于固體培養基,在95%CO2、37℃恒溫培養箱中培養,當培養基顏色由玫瑰紅色轉變為橙色者為陽性;培養基未見顏色變化為陰性。

晚孕蛻膜組織及胎盤組織所有標本均于剖宮產后按無菌程序操作獲取,標本離體后迅速快送實驗室。

蛻膜上皮培養分離純化:蛻膜條件培養液的制備改進陳曉等的方法[14],術中無菌瓶收集標本,置于盛有100 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的冰生理鹽水中,即刻送進實驗室。挑取較厚實的底蛻膜組織,在冰生理鹽水中反復吹洗,清除血污。取小片組織剪碎成糊狀(約1 m3大小),加入0.83%NH4Cl進一步破除紅細胞。再加入冰生理鹽水反復清洗組織懸液數次,待上清清亮為止。稱取剪切清洗后的蛻膜組織(濕重)300 mg,均勻接種于培養瓶,4 h后加入含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養液,次日換成無血清RPMI 1640培養5 mL,收集48 h后的培養上清,4℃,12 000 r/min離心,無菌過濾,-70℃凍干備用。

胎盤滋養細胞的分離:①將收集的胎盤組織置于DMEM中充分洗滌3次,仔細去除蛻膜及絨毛基質,將剩余組織剪碎至1 mm3左右。②加入0.125%胰蛋白酶液十37℃水浴中消化約3 0 min(不予搖晃)。期間隔5 min吸少量消化液鏡下監測,適時終止消化。③收集上清液并加10%小牛血清終止消化,100 μ m孔徑金屬篩網過濾,300 g離心10 min。④調整細胞密度為6～8×105/mL,種植于MetrigeL包被(MetrigeL:DMEM=1∶2)的塑料培養板或蓋玻片上。

1.5 培養條件

培養液為高糖型條件下培養24 h,DMEM,加入20%胎牛血清,pH值7.0～7.2,于37℃,5%C02除去未貼壁細胞并換入新鮮培養液。以后每日更換培養液。

傳代培養待原代的細胞80%匯合后,棄去培養液,用PBS洗1次,加入1∶1的 0.25%胰蛋白酶:0.02%EDTA(Na)溶液,于37℃消化5～15 min,再加入含20%血清的培養液終止消化,1 000 r/min離心8 min,吹打成單細胞,以1.0×105/mL接種于新的培養皿培養。傳代細胞約24 h可貼壁,5～7 d后約有80%聚集長滿。

1.6 LAMPS刺激試驗

LAMPS刺激前,蛻膜上皮細胞及胎盤滋養細胞分別800 rpm離心5 min,棄去培養液,無菌PBS洗滌后,用含有1%FBS的RPMI-1640培養液于細胞培養板6孔板中調整其密度為5×105/mL,37℃,5%CO2培養24 h,隨后于每孔細胞加入 不同濃度(0 、0.1、1 、2、3 μ g/L)的LAMPS加以刺激,1.5～3 h提取細胞總 RNA,刺激2～4 h提取細胞胞質蛋白,每個實驗均重復。

1.7 RT-PCR檢測hBD-2 mRMA表達

上皮細胞總RNA的提取采用上海飛捷生物公司的總RNA極速抽提試劑盒,按其說明進行。最后用尤RNA酶去離子水溶解RNA沉淀,-70℃保存備用。

引物設計根據Genbank hBD-2cDNA序列(登錄號為NM-004942.2),設計特經檢查擴增片段均跨躍內含子hBD-2跨內含子引物:上游5′-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3′,下游 5′-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3′,產物長255 bp,符合內參照,擴增片長度為RT-PCR要求,同時用PCR試劑盒里看家基因GAPDH引物為544 bp。

RT-PCR擴增:①RT:取等量(約 2 μ g)總RNA,1 μ L 隨機引物,dNTP 0.5 mmoL/L,總體積20 μ L,按照RT-PCR試劑盒說明操作。②引物稀釋按引物濃度(mmol/L)=[引物量(mg)/分子量]/體積(L),稀釋引物,使引物終濃度為25 μ mol/L,-20℃保存。③參照《基因擴增臨床檢驗指南》[15],PCR循環條件如下:95℃,變性5 min;94℃60 s,62℃30 s,72℃120 s共35個循環,72 ℃延伸5 min,取5 μ L擴增液加1 μ L溴酚藍于2%瓊脂糖凝膠電泳,電壓50 V,電泳40 min,凝膠紫外線下觀察結果,并攝相。

取誘導因素刺激過的細胞提取總蛋白,測定蛋白質濃度采用Bradford法,采用SDS-T ricine-PAGE電泳[16-19]hBD-2蛋白,電轉印后Western bLotting檢測,出現條帶后,自來水沖洗,觀察、照相。

免疫細胞化學檢測hBD-2表達用兔抗人hBD-2多克隆抗體(一抗)作免疫細胞化學檢測,二抗為山羊抗兔IgG。

2 實驗結果

不同濃度的 LAMPs(0.1～3.0 μ g/mL)能明顯誘導蛻膜上皮細胞及胎盤滋養細胞產生hBD-2,且HBD-2 mRNA表達與 LAMPs呈明顯的劑量依賴性。

相同濃度的LAMPS刺激蛻膜上皮細胞及胎盤滋養細胞,HBD-2 mRNA表達呈現出時間依賴性。

表1 添加不同濃度LAMPs對絨毛膜細胞sBD-2基因表達的影響

表2 添加不同濃度LAMPs對胎盤滋養細胞sBD-2基因表達的影響

LAMPs與細胞內sBD-2基因相對表達量的關系,用SPSS12.0統計軟件分析表中數據,在P<0.05水平下,添加不同濃度SPSS12.0,sBD-2基因的相對表達量均有顯著差異,其中添加LAMPs 3 μ g/mL 與 LAMPs 0.1 μ g/mL 之間差異極顯著,其他濃度與對照組之間差異均顯著,而且2個不同培養時間之間略有差異,此外每個濃度的2個重復之間也略有差異。結果表明在較低的濃度下,LAMPs濃度與sBD-2基因相對表達量變化基本呈正相關。

HBD-2 mRNA在正常產婦蛻膜及胎盤組織中表達量較低,而在UU感染的產婦蛻膜及胎盤組織中表達量明顯升高。

HBD-2的RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳結果顯示10例UU感染組及10例正常對照組均獲得預期的137 bp陽性片段,UU感染組HBD-2/β-actin輝度相對值為(0.63±0.09),而對照組HBD-2/β-actin輝度相對值(0.17±0.15),有統計學差異。

3 討 論

經典的支原體細胞膜由脂質雙層和膜蛋白組成,其中膜蛋白可分為2類:一類為膜本體蛋白,另一類外周膜蛋白。膜本體蛋白和外周膜蛋白統稱為脂質相關膜蛋白(LAMPS),是暴露在表面與周圍環境各種成分不斷相互作用因是影響機體免疫系統的一種主要蛋白[1]。該膜蛋可能是介導支原體黏附宿主細胞表面,進入侵宿主細胞導致細胞受損與死亡的物質基礎[2]。因此對支原體LAMPS的研究是了解支原體入侵宿主后與宿主免疫系統相互作用的關鍵。

孕期UU感染與胎膜早破密切相關[3],而支原體感染者發生胎膜早破是正常分娩者的8倍[4]。孕婦宮內感染UU造成絨毛受損,最終導致妊娠終止,其機制可能與UU產生的磷脂酶A、C促使細胞膜中游離的花生四烯酸釋放,而花生四烯酸是前列腺素的必需前體物質,能損傷胚胎組織及其附屬物而影響妊娠結局[5]。實驗證實UU產生的高分子質量物質能刺激宿主免疫活性細胞產生釋放多種細胞因子而造成早孕蛻膜的局部免疫損傷[6]。

防御素是一類分質量約為4.0～5.0 kMr,含有6個半膚氨酸殘基、二對二硫鍵的陽離子多肽。防御素不僅通過直接殺菌作用抵御入侵機體的病原微生物,還在介導獲得性免疫反應、調節機體的免疫炎癥反應和創傷修復過程中起著重要作用[7-8]。防御素2是人體中第1個被發現的可誘導性防御素,在正常女性陰道、子宮頸、子宮內膜、輸卵管、卵巢等5個組織中均有HBD-2 mRNA表達,HBD-2 mRNA在絨毛膜、絨毛及胎盤組織中表達[9]。防御素2在正常婦女生殖道及妊娠相關組織中廣泛表達,提示防御素2的基因表達調控、生物學活性對于維系正常婦女及孕婦生殖道內環境穩定、宿主天然抗感染機制中起著重要的作用。另有作者提出胎膜的作用不僅是單純的機械阻擋作用,在體外胎膜有明顯的抗菌活性,在多種細菌培養皿上,胎膜覆蓋的下方及周圍均有明顯的抑菌圈產生,而作為對照的載薄片無此效應[10]。推測胎膜的這種作用可能與防御素的產生有關。宮頸粘液具有強大而廣譜的抗菌活性,防御素在子宮頸組織中固有表達,可能是子宮頸抗感染作用的重要介質[11]。

β-防御素毫摩爾濃度時具有殺傷細菌的能力,納摩爾濃度時就具有趨化活性。β-防御素具有間接的免疫啟動作用,其可能作為不成熟樹突狀細胞和記憶T細胞的趨化因子,成為先天免疫和后天免疫系統連接的橋梁。在較低的分子濃度下,β-防御素能夠與這些細胞表面特異性的趨化因子受CCR6相結合,趨化這些細胞朝著受致病微生物侵襲的皮膚或粘膜病灶部位遷移,從而提高機體抵抗微生物感染的獲得性免疫反應水平。Becker[12]等對LPS誘導hBD2表達,啟動機體固有免疫的信號途徑進行了研究,發現LPS需要一種CD14依賴途徑啟動人支氣管上皮(hTBE)細胞合成和分泌hBD2,并最終激活NF-κ Bo由此可見,β-防御素在機體抗微生物入侵的固有性免疫和獲得性免疫中均具有重要作用,防御素作為信號分子在濃度很低時不能直接殺死致病微生物時卻能產生生物學效應。

本實驗發現β-防御素-2在正常產婦蛻膜及胎盤組織中表達量較低,而在 Uu感染的產婦蛻膜及胎盤組織中表達量明顯升高,2者有明顯差異。用不同濃度的LAMPS刺激蛻膜上皮細胞與胎盤滋養細胞產生的hBD-2表達量不一樣,當LAMPS的濃度從 0.1～3 μ g/mL,所產生的hBD-2的量逐漸增大,當濃度增加到3 μ g/mL時,所產生的hBD-2量最大,HBD-2 mRNA表達呈現濃度依賴性。相同濃度的LAMPS刺激蛻膜上皮細胞及胎盤滋養細胞,HBD-2 mRNA表達呈現出時間依賴性。Ganz等[13]在純化的防御素對人及小鼠腫瘤的作用中發現,防御素能殺傷多種腫瘤細胞,特別是對抗腫瘤壞死因子的細胞系和抗NK細胞毒因子的細胞系。它能和靶細胞膜結合,引起細胞骨架易位,從而滅活靶細胞;同時還發現其活性由微絲、鈣調節蛋白和溶酶體調節,裂解作用呈劑量和時間依賴性。

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