葛根素聯合運動對去卵巢大鼠早期骨代謝及E2水平的影響

黃 競,卜 平,楊 林,吳洪海,吳庚華,朱永澤

(揚州大學醫學院,江蘇揚州,225001)

研究認為,絕經后骨質疏松癥(PMOP),在絕經后婦女的高發率主要是因為與雌激素水平失衡有關[1-4],雌激素替代療法(ERT)在過去的70年間被作為治療骨質疏松癥的首選方法,療效肯定,能降低骨轉換率,減少骨吸收,促進骨形成,但嚴重的副作用增加了治療的風險。因此,既有雌激素樣作用又可避免其嚴重副作用的植物雌激素受到人們的關注。同時,合理的運動對骨的機械應力刺激效應能減緩絕經后骨量的丟失[5]。本實驗用有雌激素樣作用的葛根素聯合中等強度運動對去卵巢大鼠早期干預,觀察其對OCR骨代謝、骨組織結構、E2等方面的影響,探討其對OCR骨代謝的早期防治作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗藥物及試劑

雌二醇(E2):上海通用藥業股份有限公司,1 mL∶2 mg/支,國藥準字 H31021114,批號090502;葛根素:山東方明藥業股份有限公司,0.1 g∶2 mL/支,國藥準字 H20033292,批號0811301。

1.2 實驗對象

清潔級雌性健康SD大鼠48只,揚州大學比較醫學中心提供,許可證號SCXK(浙)2008-0033,12周齡,體質量300 g左右。按隨機數字表將動物分為6組,每組8只。腹腔麻醉(0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg)、手術,術后1周進行下述實驗。

A、正常對照組(假手術組):剖腹手術但不切卵巢(假手術),常規飼養,不加干預。B、模型組(AM):手術切除卵巢,常規飼養,不加干預。C、雌激素組(陽性對照組):手術切除卵巢,雌激素200 μ g/(kg·d),12 周,肌肉注射 ,常規飼養 。D、葛根素治療組:手術切除卵巢,葛根素50 mg/(kg·d),12周,腹腔注射,常規飼養。E、中等強度運動組(MIE組):手術切除卵巢,常規飼養,模擬田徑運動中周期性耐力跑的形式,參照Bedford的動物負荷標準,采用段氏ZH-PT98型動物實驗跑臺進行運動跑臺訓練。訓練大鼠的運動強度逐漸加大,開始時跑速12 m/min、持續時間20 min、跑臺傾斜度0°,隔日速度增加3 m/min、持續時間增加10 min、傾斜度增加 2°,第2周起跑速達20 m/min、持續時間達60 min、將跑臺傾斜度達5°。維持此強度運動,5 d/周,至12周。F、葛根素+中等強度運動組:手術切除卵巢,葛根素治療、運動的方法與強度分別同葛根素治療組、中等強度運動組,常規飼養。

干預12周后,麻醉,取血離心(腹主動脈穿刺取血),測定大鼠血清中鈣、磷含量(電極法);血清堿性磷酸酶(ALP)水平;E2水平(放免法);右脛骨上端HE染色,觀察骨組織結構。

2 結 果

2.1 大鼠血清鈣、磷含量

B組血Ca2+濃度高于C、D、F組,差異顯著(P<0.05或P<0.01);F組血P3+高于B組,有統計意義(P<0.05),見表1。

表1 大鼠血清Ca2+、P3+含量(±s)

表1 大鼠血清Ca2+、P3+含量(±s)

注:與A組比較,＊＊P<0.01;與B組比較,#P<0.05,##P<0.01。

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2.2 大鼠血清E2、ALP水平

C、F組ALP濃度高于B組,有統計意義(P<0.05),見表2。B組血清E2濃度低于其它組,與A、C、D 、F組有顯著差異(P<0.05或 P<0.01);A組血清E2濃度較高,與B組、E組之間有顯著差(P<0.05或P<0.01);C組與E組比較,差異顯著(P<0.05)。

表2 大鼠血清E2、ALP水平(±s)(n=8)

表2 大鼠血清E2、ALP水平(±s)(n=8)

注:與A組比較△P<0.05,△△P<0.01;與B組比較,#P<0.05,##P<0.01。

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2.3 骨組織學檢查

A組:骨細胞較多,骨小梁較厚且結構緊密,連續性好,小梁間隙小,鈣鹽沉積均勻;B組大鼠骨細胞較少,細胞周圍骨陷窩明顯,骨小梁變薄,有斷裂現象,小梁間隙增大,鈣鹽沉積不均勻;C、D、E組:骨細胞較B組增多,細胞周圍可見骨陷窩,骨小梁較B組增厚,鈣鹽沉積較均勻;F組骨細胞數量顯著增多,細胞周圍骨陷窩不明顯,骨小梁結構緊密,連續性好,小梁間隙小,鈣鹽沉積均勻。見圖1。

圖1 各組大鼠右脛骨上端骨組織變化(HE 40倍)

3 討 論

葛根素為葛根中提取的一種異黃酮類化合物,又名普拉林(Puerarin);化學名為4,7-二氫基-8-β-D葡萄糖基異黃酮;分子式:C21H20O9。研究表明,葛根素具有雌激素樣作用,可影響骨代謝。骨代謝生化標志物反映了整體骨轉換的情況,骨代謝標志物的增高表明骨高轉換狀態,骨丟失率加快。血清中的鈣、磷是血液中骨代謝重要的骨礦成分,血液中鈣、磷含量的穩定是骨吸收和骨形成平衡的重要標志。ALP是骨形成所必需的酶,是成骨細胞分化成熟和功能的標志,其表達隨著細胞分化的發展而增強,其活性反映了成骨細胞的活性;ALP是參與骨代謝的重要因子,通過分解磷酸酯的無機磷,增加其局部濃度,促進基質礦化[6]。李海等[7]研究發現,小劑量的葛根素聯合小劑量的雌二醇也能使骨密質增厚,血鈣、磷和ALP恢復正常,療效與單獨使用較大劑量的雌二醇相近;Nontakorn Urasopon等研究發現,葛根素具有促進UMR106細胞株增殖和分化的作用,表明葛根素能夠促進成骨細胞合成和分泌ALP,具有促進成骨細胞分化的作用[8]。李旭炯等用葛根素治療去卵巢大鼠發現其可升高血清E2水平,改善骨密度[9]。

運動對骨的代謝也有很強的調節功能,研究認為,主要是因為運動對骨的機械應力刺激,以及由此產生的激素和細胞因子對骨代謝產生了調節效應,合理的運動能減緩絕經后骨量的丟失[5]。鐘衛權等[10]通過動物實驗,發現中等負荷的游泳訓練與注射雌激素具有同等效應,可以改善去卵巢大鼠的骨代謝狀況,提高骨形成,抑制骨吸收,緩解骨質疏松癥狀,適度的體育鍛煉不但增加了肌肉的彈性和力量,而且肌肉牽拉刺激骨骼使骨量保持較高水平,延緩了骨量的丟失。

另有研究[11]報道,去卵巢大鼠單純補充雌激素和單純(中等強度)運動,并不能預防或改善其骨量的丟失,而運動加雌激素補充則能使大鼠骨量維持在基礎對照組水平,有效地預防了骨量的丟失,雌激素和運動對骨量的影響似乎具有良好的協同效應;有研究表明,運動和雌激素替代的聯合療法對絕經后婦女椎骨骨量的增加有疊加作用或協同作用,對整體骨量的增加有協同作用[11-12]。

本實驗選用3月齡性成熟期雌性SD大鼠造成去卵巢骨質疏松模型,在卵巢去勢后1周,骨量還未明顯丟失前即進行早期干預,強調“防”的作用大于“治”。經12周干預后,模型組血清Ca2+濃度高于空白組、葛根素組、葛根素聯合運動組(P<0.05或P<0.01)(見表1),HE染色可見脛骨骨細胞較少,細胞周圍骨陷窩明顯,骨小梁變薄,有斷裂現象,小梁間隙增大,鈣鹽沉積不均勻,說明大鼠去卵巢后,雌激素水平下降,骨代謝處于高轉換狀態,其ALP水平低于C、D、E、F四組干預組,提示其成骨水平低,與其血Ca2+濃度高符合。補充雌激素、葛根素、或葛根素聯合運動干預后,其血Ca2+濃度明顯低于模型組,E2高于模型組(P<0.05),提示干預措施對骨形成有促進作用;單純運動刺激,其血Ca2+濃度水平較高,ALP水平較低,E2水平和模型組接近(P>0.05),提示其對促進骨形成的影響力弱;葛根素聯合運動組血Ca2+濃度水平較低,P3+濃度水平較高,ALP與E2水平較高,和模型組間差異顯著(P<0.05),HE染色骨細胞數量顯著增多,細胞周圍骨陷窩不明顯,骨小梁結構緊密,連續性好,小梁間隙小,鈣鹽沉積均勻,與空白組、E2組相近,提示其成骨作用明顯,骨代謝的高轉換狀態受到抑制,表明葛根素聯合運動對去卵巢大鼠早期干預,能延緩骨量丟失,減慢骨密度的衰退。其作用機理及二者間的疊加和/或協同作用需進一步深入研究。

[1]Messinger-Rapport B J,Thacker H L.Prevention for the older woman.:A practical guide to prevention and treatment of osteoporosis[J].Geriatrics,2002,57(4):16.

[2]Marcus R.Post-menopausal osteoporosis[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol,2002,16(3):309.

[3]Raisz L G.Pathogenesis of osteoporosis:concepts,conflicts,and prospects[J].J Clin Invest,2005,115(12):3318.

[4]Aoto H,Sasaki H,Ishino M,et al.Nuclear translocation of cell adhesion kinase beta/proline-rich tyrosine kinase 2[J].Cell Struct Funct,2002,27(1):47.

[5]陳曉紅,鄭 陸.運動、骨代謝、細胞因子研究進展[J].中國運動醫學雜志,2008,27(6):784.

[6]Utting J C,Robins S P,Brandao Burch A,et al.Hypoxia inhibits the growth,differentiation and bone-forming capacity of rat osteoblasts[J].Experimental Cell Research,2006,312(10):1693.

[7]李 海,王金花,黃海玲.葛根素聯合雌二醇干預去卵巢大鼠骨組織和骨代謝的變化[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,14(46):8616.

[8]Nontakorn Urasopon,Yuzuru Hamada,Wichai Cherdshewasart,et al.Preventive effects of Pueraria mirifica on bone loss in ovariectomized rats[J].Maturitas,2008,59(2):137.

[9]李旭炯,張翠英.葛根素對去卵巢大鼠骨密度及血清IL-6的影響[J].長治醫學院學報,2009,23(1):13.

[10]鐘衛權.不同負荷的游泳訓練及雌激素對去卵巢大鼠骨質疏松癥的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,17(11):3351.

[11]章曉霜,李青南,胡 彬,等.不同強度跑臺運動與雌激素聯合作用對實驗性骨質疏松大鼠骨量的影響[J].中國康復醫學雜志,2002,17(2):75.

[12]張文平.體育鍛煉對絕經期婦女雌激素、骨代謝和骨密度的影響[J].現代康復,2000,4(9):1326.