噬菌體生物擴增法檢測尿液結核分枝桿菌對腎結核的診斷價值探討

何建 陳冬云 魏嬌

(湖北省宜昌市第三人民醫院 宜昌 443003)

噬菌體生物擴增法檢測尿液結核分枝桿菌對腎結核的診斷價值探討

何建 陳冬云 魏嬌

(湖北省宜昌市第三人民醫院 宜昌 443003)

目的利用噬菌體生物擴增法檢測尿液結核分枝桿菌,評價其對腎結核診斷價值。方法對腎結核患者63例應用涂片抗酸染色法檢測結核分枝桿菌、結核分枝桿菌培養、噬菌體生物擴增法進行尿液結核分枝桿菌檢測,聚合酶鏈反應法檢測結核菌DNA。同時選正常人群21人作為對照組行尿液噬菌體生物擴增法檢測結核分枝桿菌,聚合酶鏈反應法檢測結核分枝桿菌DNA>。結果腎結核患者尿液行噬菌體生物擴增法檢測結核分枝桿菌陽性率明顯高于涂片抗酸染色法檢測結核分枝桿菌及結核分枝桿菌培養(P＜0.01)。與PCR法比較差異無統計學意義(P＞0.05),噬菌體生物擴增法檢測尿液中結核分枝桿菌對腎結核診斷有較高的特異度(95.2%)和靈敏度(69.8%)>。結論噬菌體生物擴增方法檢測尿液結核分枝桿菌對腎結核診斷具有重要的參考價值。

結核,腎/尿;分枝桿菌,結核;細菌噬菌體

腎結核常需通過臨床表現與實驗室檢查,影像學檢查等相結合來進行診斷。但由于腎結核早期癥狀輕微及不典型病例的增加,易造成診斷延誤或漏診。如何提高腎結核的診斷率并縮短確診時間是結核病防治工作中需面對的問題。我們通過對63例腎結核患者采用噬菌體生物擴增法(phage amplified biologically assay,PhaB)檢測尿液液中的結核分枝桿菌,來評價其對腎結核的診斷價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象 按入院先后順序選擇2006年1月—2010年2月確診的腎結核住院患者63例,其中男37例,女26例,年齡25～67歲,平均 36歲。結核部位：左腎22例,右腎 29例,雙腎12例。合并輸尿管結核19例,膀胱結核5例。泌尿生殖系統外結核6例,其中肺結核 4例,腰椎結核1例,胸壁結核1例。本組患者中有尿路刺激癥狀 44例(69.8%),血尿 21例(33.3%),腰痛 48例(76.2%),發熱 7例(11.1%),僅有輕微腰痛、無顯著膀胱刺激癥狀等不典型表現8例(12.7%)。63例患者行靜脈腎盂造影(IVP)檢查有異常者58例,占92.1%,診斷為腎結核22例,占34.9%。行IVP檢查診斷腎結核的22例中提示腎盞破壞,邊緣不整如蟲蝕10例,空洞破壞腎盂并與腎盂融合5例,腎皮質一致性變薄3例,分離性、不均衡性腎積液4例。IVP檢查示輸尿管異常19例,其中輸尿管邊緣不整 6例,積液擴張 8例,僵硬變細 2例,呈“串珠狀”改變3例。行IVP檢查異常但定性困難的其他36例中表現為腎盂腎盞稍微變形14例,腎小盞杯口稍模糊8例,小空洞形成3例,腎積液(不排除泌尿系結石)4例,腎皮質局部變薄2例,患腎不顯影5例。63例患者行B超檢查25例診斷為腎結核,此25例中腎實質內出現邊緣不清的低回聲區7例,腎實質內有邊緣不規則的無回聲區,內部有點狀與絮狀回聲區者5例,腎盞腎盂內呈無回聲區的積液圖像8例,腎臟縮小,腎實質與腎盂腎盞界限不清5例。35例行膀胱鏡檢查,鏡下膀胱黏膜慢性水腫充血32例,占91%(32/35),其中膀胱內壁結節3例,膀胱內壁潰瘍5例。未見明顯異常3例,占8.6%(3/35)。8例行膀胱內壁結節或潰瘍處肉芽組織取活組織進行病理檢查診斷為膀胱結核5例,慢性炎癥3例。25例行患側輸尿管逆行插管,發現輸尿管完全梗阻8例,占32%(8/25)。所有腎結核患者除影像學檢查有結核病的表現或可疑表現外,均符合以下2項中任何一項：(1)尿結核分枝桿菌培養或(和)尿沉渣涂片抗酸染色陽性;(2)病理檢查證實有結核病變;并結合臨床表現和實驗室各種檢查結果作出診斷。同時選在我院體檢的正常人群21作為對照組,行尿液噬菌體生物擴增法檢測結核桿菌及聚合酶鏈反應法檢測結核菌DNA。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床觀察指標 63例腎結核患者入院后即留取24 h尿沉渣做涂片抗酸染色法檢查結核分枝桿菌3次、行尿液噬菌體生物擴增法檢測結核分枝桿菌、結核分枝桿菌培養,聚合酶鏈反應法檢測結核分枝桿菌DNA。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 PhaB法 按照結核分枝桿菌噬菌體法檢測試劑盒(進口藥品注冊證：S20060045,生產批號：I-9-21,生產企業：BIOTEC Laboratories Ltd)說明書配制所需試劑。所有操作均在無菌條件下進行。操作如下：(1)尿液標本前處理。每份尿液標本加1倍體積4%NaOH液化,放置約15 min,4000轉/min離心15 min,去上清,沉淀物中加入1 ml完全培養基混勻,轉移至無菌反應管中備用。(2)噬菌體侵染。取噬菌體0.1ml加入反應管中充分混勻,37℃孵育1 h。(3)終止侵染。加入0.1 ml殺毒劑,充分混勻,室溫放置5 min后加入5 ml培養液和1 ml指示細胞。(4)澆注平皿與培養。上述混合培養液與5 ml溶解瓊脂液混勻后倒入無菌平皿中,旋轉混勻,待凝固成型,置于37℃培養18～24 h,每次檢測要同時設定陽性對照和陰性對照平皿。結果判定：≥20個菌斑為陽性。

1.2.2.2 聚合酶鏈反應法檢測結核分枝桿菌DNA。采用結核分枝桿菌核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒(批準文號：國藥準字S20063112,生產企業：成都永安制藥有限公司),嚴格按照試劑盒廠家提供的使用說明和操作步驟完成相應檢測并判斷結果。

1.2.2.3 尿液結核桿菌涂片觀察 治療前留取24 h尿液濃縮涂片抗酸染色檢查結核桿菌3次。具體操作按《結核病診斷細菌學檢驗規程》[1]進行。采用的顯微鏡為OLYMPUS COVER-015型。

1.2.2.4 結核分枝桿菌培養觀察 治療前行尿液結核分枝桿菌培養,培養用改良羅氏培養基。培養8周未見生長即報陰性結果。對培養陽性者經對硝基苯甲酸(PNB)培養基及噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養基進行菌種鑒定證實為結核分枝桿菌生長。

1.3 統計學處理 以SPSS10.0軟件對數據進行統計學分析。率比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 四種檢測方法的陽性率比較 見表1。

表1 4種檢測方法的陽性率陰性率比較

采用噬菌體生物擴增法陽性率與涂片抗酸染色法陽性率比較χ2=21.46 P＜0.001,采用噬菌體生物擴增法陽性率與結核分枝桿菌培養陽性率比較χ2=16.81 P＜0.01,采用噬菌體生物擴增法陽性率與聚合酶鏈反應法檢測結核菌DNA陽性率比較χ2=0.64 P ＞0.05。

2.2 PhaB法及聚合酶鏈反應法檢測結核分枝桿菌DNA兩種方法特異度、敏感度比較 見表2。

正常人群21人行尿液噬菌體生物擴增法檢測結核分枝桿菌1例檢測陽性,聚合酶鏈反應法檢測結核菌DNA 3例檢測陽性。

表2 2種測定結果的特異度、敏感度及95%可信區間(%)

3 討論

腎結核的典型臨床特征為逐漸加重的尿頻、尿痛和血尿3大癥狀。近年臨床表現不典型者增多。我們總結本院收治的63例腎結核患者中,有8例患者不存在上述3大癥狀的不典型病例。這些不典型病例給腎結核的診斷帶來了困難,造成了誤診,因而延誤了最佳藥物治療時期。

在腎結核的影像學診斷中X線檢查中IVP是最常用的檢查方法。63例腎結核患者IVP檢查發現有異常的占 90%以上,診斷為腎結核只占34.9%,主要原因如下：(1)在腎結核早期,病變局限在腎乳頭,IVP檢查常常無特殊表現;只有在腎實質明顯破壞時才出現改變;(2)當患腎廣泛破壞時,患腎不顯影,IVP上不能顯示典型的結核性破壞病變;(3)一些不典型表現如小空洞常難于與腎囊腫相鑒別;(4)腸內容物較多時也會影響病灶的觀察,有時也受人為和客觀因素的影響;(5)IVP只能通過腎盂、輸尿管及膀胱顯影評價,一些異常表現常難與慢性腎盂腎炎、腎乳頭壞死、黃色肉芽腫性腎盂腎炎等疾病相鑒別。

理論上尿液濃縮作涂片抗酸染色法檢查結核分枝桿菌、結核分枝桿菌培養及病理學診斷是診斷腎結核金標準。我院35例患者行膀胱鏡檢查僅5例行膀胱病檢確診結核病變而輔助診斷腎結核,陽性率不高,且為侵入性檢查,臨床使用受限。文獻報道尿沉渣涂片作抗酸染色找抗酸桿菌陽性率一般為50%～70%;尿液結核分枝桿菌培養陽性率可高達45%～80%。本組研究中尿液涂片法找到結核分枝桿菌18例(28.6%),結核分枝桿菌培養陽性僅21例(33.3%),低于文獻報道。分析其可能的原因如下：(1)尿液中含結核分枝桿菌數量較少,(2)患側輸尿管的閉塞或狹窄,輸尿管堵塞閉鎖、腎自截等影響結核分枝桿菌的排出。(3)腎結核的結核分枝桿菌常間隙性排出,使尿檢結核分枝桿菌陰性。(4)可能與實驗室條件及操作等原因有關。

自PCR法用于檢測結核分枝桿菌以來,我國陸續有類似報道采用該法檢測尿液中的結核分枝桿菌。其陽性率明顯高于尿結核菌抗酸染色檢查及尿結核分枝桿菌培養。國外報道其陽性率達94.3%[2]。我們的資料顯示尿PCR-TB陽性率為76.2%(48例),與采用噬菌體生物擴增法陽性率比較差異無統計學意義。但由于臨床標本擴增和培養標本體積的巨大差異,易于污染,實驗室條件及操作等原因,可出現假陰性和假陽性結果。本院結果顯示假陰率23.8%(15例),假陽性率14.3%(3例)。需要指出的是目前的結核分枝桿菌PCR檢測商業試劑盒,由于基本上都僅針對1個(或幾個)結核分枝桿菌特異性基因靶序列進行擴增檢測,只能夠作為輔助參考,不能作為結核病診斷的主要指標,因此不能單獨作為臨床診斷腎結核的標準,必須同時參照結核分枝桿菌的傳統微生物學檢查的結果并參考其他臨床檢查手段所得到的結果進行綜合判斷[3]。

噬菌體生物擴增方法是近年來建立的一種細菌學快速診斷新技術,其原理是：當臨床標本中含有活的結核分枝桿菌時,噬菌體就可侵入菌體內進行大量繁殖,最終裂解菌體,釋放出來的噬菌體可感染指示細胞,使指示細胞裂解,在瓊脂上出現噬菌斑。此方法用于快速檢測結核分枝桿菌已有很多文獻報道[4-5]。胡忠義等[6]用其檢測痰標本中的結核分枝桿菌,在200～500條/ml時即可檢出,而傳統的涂片和培養檢測MTB靈敏度為1×103～1×104條/ml。

鑒于PhaB法的優點,我們用該法檢測尿液中的結核分枝桿菌,陽性率與涂片抗酸染色法檢測結核分枝桿菌、結核分枝桿菌培養相比較差異有統計學意義(P＜0.01)。該法特異度達到95.2%,靈敏度達到69.8%。雖靈敏度低于PCR法,但由于特異度略高于PCR-TB,而且可以在18～24 h內觀察結果,因此可以快速、可靠地檢測結核分枝桿菌,對早診斷、早治療具有重要的參考價值。

相比較于PCR法,該法的最大優點是一旦結果陽性可以診斷為活菌生長,而PCR法無論死還是活的結核分枝桿菌仍可以得出陽性結果,因此PhaB法對臨床治療可以提供治療有效參考。在對照組正常人群中有1例噬菌體檢測陽性,但從臨床癥狀、尿常規、泌尿系B超檢查均未發現有泌尿系結核依據?？紤]原因如下：(1)噬菌體生物擴增方法實際操作影響因素較多,如反應時間、溫度、噬菌體活性、殺病毒劑濃度等;(2)與少數幾種非結核分枝桿菌有交叉反應,如恥垢分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥胞內分枝桿菌等也可出現陽性反應;(3)不排除病理性腎結核可能,因腎臟微小病灶自行愈合常規檢測不能查出。對該檢測陽性者進行隨訪觀察,1年后行噬菌體生物擴增方法檢測尿液結核分枝桿菌為陰性,尿常規、泌尿系B超復查無異常。因此考慮為實驗室誤差可能性大。從實驗過程來說為了避免誤差,我們的體會是應注意以下幾點：(1)留取標本前受檢者應盡量清洗尿道外口部防止污染;(2)操作中可對尿液標本進行前處理,消化結核分枝桿菌周圍物質,使結核分枝桿菌充分暴露,噬菌體容易接觸并進入結核分枝桿菌通過前處理而得到更為真實可靠的結果。

另外按科研設計要求,對照組還應設立非結核分枝桿菌泌尿系感染者、泌尿系非感染性疾病者,因文中研究時間內無符合數目的相應病例,故未設其他對照組,是本文存在的不足。

以上綜合結果表明,采用PhaB法檢測腎結核患者尿液標本結核分枝桿菌具有較高的敏感性和特異性,同時簡便、快速;全程只需要48h,加上本法檢測的是活菌,因此可為腎結核的診斷提供有力依據,這對早期診斷,從而積極治療具有重要參考價值。

[1]中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程[J].中國防癆雜志,1996,18(1)：28-30.

[2]Hemal AK,Gupta NP,Rajeev T P,Kumar R,Dar L,Seth P.Polymerase chain reaction in clinically suspected genitourinary tuberculosis：comparison with intravenous urog raphy,bladder biopsy,and urine acid fast bacilliculture[J].Urology,2000,56(4),570-574.

[3]中華醫學會.臨床技術操作規范結核病分冊[M].北京：人民軍醫出版社,2004：47-48.

[4]辛茶香,諸紀芬,方育霞.噬菌體生物擴增法檢測涂陰肺結核患者痰標本的臨床應用價值[J].實驗與檢驗醫學,2009,27(3)：2121-213.

[5]夏洪嬌,劉劍榮,彭可君,陳華良.噬菌體生物擴增法結合熒光染色法快速檢測結核分枝桿菌[J].臨床和實驗醫學雜志,2008,7(11)：80-81.

[6] 胡忠義,倪蓮娣,靳安佳,董惠賢,鐘敏,李建農,翁心華.噬菌體生物擴增法快速檢測結核分枝桿菌方法學研究[J].中華結核和呼吸雜志,2004,27(12)：801-805.

The diagnostic value for renal tuberculosis by detection of Mycobacterium tuberculosis from Urine with phage amplified biologically assay

He Jian,Chen Dongyun,Wei Jiao
Department of Tuberculosis Disease,The third people's Hospital of Y ichang,Y ichang443003,China

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value for renal tuberculosis by detection ofMycobacterium tuberculosisfrom Urine with phage amplified biologically(phaB)assay.Methods63 patients with renal tuberculosis and 21 healthy subjects were recruited as research group and control,respectively.We detectedMycobacterium tuberculosisin the urine from research group patient using smear,culture and phaB.Meanwhile TB-DNA were detected from the urine by polymerase chain reaction(PCR).The urine from the control were detected using phaB and PCR.ResultsThe positive rate of detection forMycobacterium tuberculosisfrom urine by phaB in research group was significant higher than that by smear and culture(P＜0.01).But the positive rate was no significant difference between using phaB and using PCR(P＞0.05),Specificity and sensitivity of phaB for detectingMycobacterium tuberculosisfrom urine was 95.2%and 69.8%,respectively.ConclusionPhaB is useful tool to detectMycobacterium tuberculosisfrom urine for diagnosis of renal tuberculosis.

tuberculosis,renal/urine;Mycobacterium tuberculosis;bacteriophages

He Jian(hejian0914@sina.com)

何建(hejian0914@sina.com)

2010-11-21)

(本文編輯：范永德)