吐溫80對9-硝基喜樹堿脂質體藥物動力學性質的影響

張晶晶 ，陳 軍 ，方 蕓

1南京大學醫學院附屬鼓樓醫院藥劑科，南京 210008；

2南京中醫藥大學藥學院，南京 210029

目前的抗腫瘤藥物脂質體普遍采用了長循環技術，應用聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPEPEG）作為長循環材料的抗癌藥物脂質體已經在臨床上得到應用，但是這種材料價格昂貴，目前難以得到推廣應用。研究表明，在脂質體中摻入表面活性劑吐溫80也可以通過改善表面親水性而達到長循環效果[1,2]。吐溫80摻入后，脂質體中磷脂極性頭部被吐溫 80的聚氧乙烯基所覆蓋，伸出的親水性聚氧乙烯基提供了長循環脂質體的立體位阻[3]。有文獻[4]比較了吐溫80與DSPE-PEG2000修飾對超氧化物歧化酶脂質體藥物動力學的影響，結果表明兩種修飾都具有顯著的長循環效果，但DSPEPEG2000的效果更好。由于吐溫80修飾的長循環效果確切且機理清楚，因此我們采用其替代DSPEPEG作為修飾材料制備長循環脂質體，并考察了對9-硝基喜樹堿（9-nitrocamptothecin，9-NC）脂質體體內藥物動力學、尤其是內酯型/羧酸鹽型平衡的影響 （有關長循環脂質體和普通脂質體對9-NC內酯型/羧酸鹽型平衡作用的比較尚未見報道）。

1 實驗材料

1.1 儀器與設備

HP Agilent 1100高效液相色譜儀（包括G1312A二元泵，G1313A自動進樣器，G1314A紫外可變波長檢測器）；TGL-16G高速離心機 （上海安亭科學儀器廠）；XW-80A旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

9-NC原料藥（中國藥科大學藥物化學教研室提供，純度＞99%），9-NC 脂質體（采用薄膜法自制）；甲醇（色譜純）；二甲基亞砜、聚乙二醇400、無水乙醇、三乙胺、冰醋酸均為分析純；吐溫80（中國醫藥集團上海化學試劑公司，化學純）；其它試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

健康SD大鼠，230-280g，♂，購置于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。

2 方法與結果

2.1 RP-HPLC法測定大鼠血漿中9-NC內酯型濃度和總濃度參考文獻[4-5]。

2.2 9-NC脂質體的制備

精密稱取處方量的磷脂、膽固醇和9-NC（物質的量比為72︰24︰1），用無水乙醇溶解后，減壓1 h除去溶劑成膜。真空干燥過夜，加入pH5.9磷酸鹽緩沖液4 mL，37℃旋轉水合120 min。水合液于冰浴中探頭超聲（200 W，300次）后即得9-NC脂質體。

2.3 吐溫80修飾的9-NC脂質體的制備

按磷脂用量1/5的物質的量之比在成膜時加入吐溫80，其余處方工藝同“2.2節”項下制備，樣品作為“2.4項下”藥物動力學研究。

12只大鼠隨機分為兩組，按1.5 mg·kg-1劑量分別尾靜脈注射給予9-NC普通脂質體和吐溫80修飾的脂質體后，于不同時間點取血，4000 r·min-1離心3 min，取血漿200 μL，處理后測定9-NC內酯型濃度和總濃度。采用統計矩模型、利用3P97程序計算藥物動力學參數。兩組之間的藥物動力學參數比較采用t檢驗。

在選定的色譜條件下，血漿中9-NC內酯型濃度和總濃度的定量不受干擾。

低、中、高3個濃度方法回收率分別為99%±3%，98.5%±0.3%，101.2%±0.4%；日內 RSD 均≤4.0%；日間RSD均≤6.0%；酸化回收率分別為98%±5%，99%±7%，101%±4%。

2.4藥物動力學比較

兩組大鼠藥物動力學試驗結果見表1和圖1。

從表1中可見，采用表面活性劑吐溫80進行修飾后，9-NC內酯型和總濃度的AUC分別提高了1.47倍和1.65倍，內酯型和總濃度的清除率CL和表觀分布容積（Vss）顯著下降（P＜0.01）。此外，總濃度的平均滯留時間（MRT）以及半衰期t1/2延長（P＜0.05），表明具有一定的長循環效果。

按AUC0-∞計算[6]，吐溫80修飾前后的9-NC脂質體的內酯型比例分別為50%±6%和43%±6%?？梢?，吐溫修飾使得內酯型比例有所下降，但沒有顯著性差異。

表1 大鼠靜注1.5 mg·kg-19-NC、9-NC脂質體或吐溫80修飾脂質體的藥動學參數（n=6,±s）

表1 大鼠靜注1.5 mg·kg-19-NC、9-NC脂質體或吐溫80修飾脂質體的藥動學參數（n=6,±s）

aP＜0.05,bP＜0.01,cP＜0.001 vs 9-NC 脂質體

3 討 論

文獻[7]報道，根據劑量折算，9-NC游離藥物大鼠靜脈注射劑量為3 mg·kg-1。采用脂質體包封后，AUC顯著提高，有效劑量相應地下降。因此在表面活性劑修飾的藥物動力學研究部分，我們改用了文獻報道的9-NC靜脈注射用制劑所采用的1.5 mg·kg-1劑量[8]。

當吐溫80用量與磷脂用量的物質的量比為20%時，1HNMR圖譜可見卵磷脂的膽堿頭部甲基峰明顯變小，當用量提高到50%時，磷脂的極性頭部為吐溫80中聚氧乙烯基所覆蓋直至完全覆蓋，在1HNMR譜圖中表現為該峰的消失[3]。但是當吐溫80的物質的量比達到50%時，表面活性劑開始增溶脂質體而形成混合膠團[9]，因此我們選擇了20%的用量。

吐溫80修飾的結果表明可以顯著提高脂質體包封的藥物在血漿中的AUC，延緩清除和減小表觀分布容積 （P＜0.01），延長總濃度的MRT和t1/2(P＜0.05)，具有一定的長循環效果。吐溫80修飾后，9-NC脂質體靜脈注射的內酯型比例有所下降，但沒有統計學顯著性差異。這一結果是由于脂質體表面采用表面活性劑修飾以后，對體內9-NC內酯型/羧酸鹽型平衡可能產生相反的影響：一方面，延長了9-NC在循環中的停留時間，抑制了9-NC從血漿中的清除，而這種清除是有利于內酯型穩定的，因此表面活性劑修飾后的長循環作用可能不利于9-NC內酯型的穩定；另一方面，在一定程度上阻止了血漿蛋白在脂質體表面的吸附（調理作用），而血漿蛋白的吸附有利于脂質體中羧酸鹽型的穩定[10]，因此這種抑制作用可能會有利于9-NC內酯型的穩定。吐溫80修飾脂質體對體內9-NC內酯型/羧酸鹽型平衡的影響可能是兩方面作用相互抵消后的結果。

[1] 張景勍，張志榮，陳開杰，等.長循環脂質體的研究進展[J]. 藥學進展，2003，27（3）：139-42.

[2] Burke WE,Leitzke S,Diederichs JE,et al.Surfacemodified amikacin-liposomes:organ distribution and interaction with plasma proteins [J].J Drug Targeting,1998,5(2):99-108.

[3] 趙 蓉，朱家璧.全反式維甲酸立體穩定脂質體的制備[J]. 藥學學報，2000，35（12）：921-3.

[4] 張云龍，謝 英，王會娟，等.超氧化物歧化酶脂質體在大鼠體內的藥代動力學和組織分布 [J].藥學學報，2005，40（2）：173-7.

[5] 陳 軍，平其能，張晶晶，等. HPLC法測定人血漿中9-硝基喜樹堿內酯型濃度和總濃度 [J].中國藥房，2009，20（2）：111-3.

[6] Chow DS,Gong L,Wolfe MD,et al.Modified lactone/carboxylate salt equilibria in vivo by liposomal delivery of 9-nitrocamptothecin[J].Ann NY Acad Sci,2000,922:164-74.

[7] Zhong DF,Li K,Xu JH,et al.Pharmacokinetics of 9-nitro-20(s)-camptothecin in rats [J].Acta Pharmacol Sin,2003,24(3):256-62.

[8] 李珺嬋，方曉玲，沙先誼，等.9-硝基喜樹堿半固體脂質納米粒的制備及大鼠的藥動學研究[J].中國醫藥工業雜志，2004，35（10）：599-602.

[9] 胥傳來，姚惠源.聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯與脂質膜間的相互作用的研究[J]. 精細化工，2004，21（13）：897-902.

[10] Mi Z,Burke TG.Differential interaction of camptothecin lactoneand carboxylate formswith human blood components[J].Biochem,1994,33(34):10325-36.