梯度洗脫高效液相色譜法檢測(cè)注射用替加環(huán)素的有關(guān)物質(zhì)

謝安云，徐潔昵，陳麗華

替加環(huán)素(Tigecycline，商品名:Tygacil)為甘氨酰環(huán)素類抗生素，其結(jié)構(gòu)與四環(huán)素類藥物相似，具有超廣譜抗菌活性，對(duì)革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性需氧菌、非典型致病菌以及厭氧性細(xì)菌，特別是對(duì)耐藥致病菌(如 MRSA、PRSP、VRE)和對(duì)糖肽類抗生素敏感性降低的葡萄球菌均具有很高的活性。此外，替加環(huán)素對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌，以及包括大部分脆弱擬桿菌在內(nèi)的多數(shù)腸桿菌屬也具有活性［1-2］。根據(jù)替加環(huán)素的合成工藝，本品中可能存在的雜質(zhì)主要有反應(yīng)初始物米諾環(huán)素、中間體9-氨基米諾環(huán)素、9-硝基米諾環(huán)素以及反應(yīng)副產(chǎn)物4-差向相異構(gòu)體。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，替加環(huán)素與9-氨基米諾環(huán)素、4-差向相異構(gòu)體的極性相對(duì)接近，而與米諾環(huán)素、9-硝基米諾環(huán)素的極性差異較大，采用一般的等強(qiáng)度洗脫難以實(shí)現(xiàn)各中間體及主峰的同時(shí)分離，故本文選用梯度洗脫方式，對(duì)本品有關(guān)物質(zhì)檢查，并進(jìn)行方法學(xué)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀(515泵，2487檢測(cè)器，7725i手動(dòng)進(jìn)樣器);大連依利特EC2000色譜數(shù)據(jù)工作站及泵控系統(tǒng);大連依利特ZW柱溫箱;北京通用TU1810紫外-可見分光光度計(jì);Mettler AE100電子分析天平;Gemini C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱。

1.2 試藥 乙腈(色譜純，Caledon Laboratories LTD)、磷酸氫二鉀、亞硫酸氫鈉、氫氧化鉀、乙二胺四乙酸二鈉(分析純，湖南師大化學(xué)試劑廠);水(樂(lè)百氏純水);注射用替加環(huán)素(批號(hào):100401、100402、100403，由長(zhǎng)沙市華美醫(yī)藥科技有限公司提供)、9-氨基米諾環(huán)素(HPLC純度＞95%，由長(zhǎng)沙市華美醫(yī)藥科技有限公司提供)、鹽酸米諾環(huán)素(HPLC純度＞98%，重慶萊美藥業(yè)有限公司提供)、替加環(huán)素對(duì)照品(批號(hào):090908，純度:99.5%，由長(zhǎng)沙市華美醫(yī)藥科技有限公司提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Waters C18(5 μm，416 mm×250 mm);流動(dòng)相:以磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鉀4.35 g、乙二胺四乙酸二鈉0.93 g，加水950 mL溶解，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.4)-乙腈(95∶5)為流動(dòng)相A，以磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鉀4.35 g、乙二胺四乙酸二鈉0.93 g，加水500 mL溶解，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.4)-乙腈(5∶5)為流動(dòng)相B;梯度洗脫條件:0～40 min，A:85%→57%;40～55 min，A:57%→0%;55 ～56 min，A:0%→85%;檢測(cè)波長(zhǎng):248 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣濃度:200 μg/mL;進(jìn)樣量:20 μL。

替加環(huán)素與中間體9-氨基米諾環(huán)素、米諾環(huán)素均在248 nm的波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，故選擇248 nm為本品有關(guān)物質(zhì)檢查的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 溶劑的配制 盡管本品易溶于水，但其在水溶液中的穩(wěn)定性較差?？紤]本品的理化性質(zhì)，并參照相關(guān)文獻(xiàn)，制備含有還原劑的溶液作為稀釋液。具體制備方法:取4.35 g磷酸氫二鉀和0.5 g亞硫酸氫鈉于1 000 mL量瓶中，加水溶解，并稀釋至刻度，用1 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，作為稀釋溶劑。

2.3 溶液的制備 供試品溶液的制備:取本品適量(約相當(dāng)于替加環(huán)素25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。對(duì)照溶液的制備:精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。系統(tǒng)適用性溶液的制備:精密稱取9-氨基米諾環(huán)素、鹽酸米諾環(huán)素各約12.5 mg，分別置100 mL量瓶中，用溶劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密稱取替加環(huán)素對(duì)照品約50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加上述溶劑50 mL使溶解，加三氟醋酸2滴，搖勻，置60～70℃的水浴中加熱約5 min，放冷;精密加入9-氨基米諾環(huán)素、米諾環(huán)素儲(chǔ)備液各1 mL，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在選定的色譜條件下，取系統(tǒng)適用性溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，9-氨基米諾環(huán)素、替加環(huán)素差向異構(gòu)體、替加環(huán)素、米諾環(huán)素的保留時(shí)間分別為14.4、16.0、21.3、34.7 min，各色譜峰之間的分離度均大于2.0。替加環(huán)素主峰理論板數(shù)70 710。色譜圖見圖1。

圖1 混合溶液的HPLC色譜圖

2.5 專屬性試驗(yàn) 貯備液的配制:照“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，作為貯備液。

酸破壞試驗(yàn):量取貯備液9 mL，置具塞比色管中，加1 mol/L HCl溶液1 mL，搖勻，置室溫下放置8 h，用1 mol/L NaOH溶液中和，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為酸破壞溶液。

堿破壞試驗(yàn):量取貯備液9 mL，置塑料瓶中，加1 mol/L NaOH溶液1 mL，室溫下放置20 h。用1 mol/L HCl溶液中和，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為堿破壞溶液。

氧化破壞試驗(yàn):量取貯備液9 mL，置塑料瓶中，加30%雙氧水溶液1 mL，搖勻，放置10 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為氧化破壞溶液。

高溫破壞試驗(yàn):量取貯備液9 mL，置具塞比色管中，置95℃水浴中加熱1 h，放冷至室溫，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為高溫破壞溶液。

測(cè)定:精密量取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖。由試驗(yàn)結(jié)果可見，本品在酸、堿、氧化、高溫環(huán)境中較不穩(wěn)定，有較多的降解雜質(zhì)產(chǎn)生。在該色譜條件下，各試驗(yàn)條件下破壞的降解產(chǎn)物均能與本品主峰獲得基線分離，表明該色譜系統(tǒng)的專屬性較好，能有效檢測(cè)本品的降解雜質(zhì)。色譜圖見圖2。

2.6 供試品溶液的穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，分別置室溫條件及低溫(0～4℃)條件下放置，于0、2、4、6、8 h 時(shí)，分別精密量取 20 μL 進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下放置，RRT為0.5的雜質(zhì)增加明顯;低溫條件放置8 h，各雜質(zhì)均無(wú)明顯變化。故實(shí)驗(yàn)過(guò)程中供試品溶液應(yīng)臨時(shí)新配，并避光、低溫放置。

2.7 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照溶液20 μL進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)平行分析6次，記錄色譜圖，量取主峰面積，RSD為0.7%。

2.8 檢測(cè)限 精密量取貯備液適量，用溶劑逐級(jí)稀釋成一系列濃度的稀溶液，分別精密量取各溶液20 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。當(dāng)進(jìn)樣濃度為0.18 μg/mL時(shí)，主峰的S/N≈3，即最低檢測(cè)限為0.18 μg/mL × 20 μL=3.6 ng。

2.9 樣品中的有關(guān)物質(zhì)檢查 各批樣品均按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液與對(duì)照溶液。精密量取對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10%～20%。再精密量取供試液和對(duì)照液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，溶劑峰忽略不計(jì)，量取各單個(gè)雜質(zhì)峰面積，與對(duì)照液主峰面積比較。9-氨基米諾環(huán)素的峰面積不得大于主峰面積的0.7倍(0.7%)，替加環(huán)素差向異構(gòu)體的峰面積不得大于對(duì)照液主峰面積的3倍(3.0%)，米諾環(huán)素的峰面積不得大于對(duì)照液主峰面積的1/2(0.5%)，其他單個(gè)雜質(zhì)，峰面積不得大于對(duì)照液主峰面積的1/5(0.2%)，除差向異構(gòu)體外的其他雜質(zhì)，峰面積之和不得大于對(duì)照液主峰面積的3倍(3.0%)。三批供試品的測(cè)定結(jié)果見表1。

圖2 不同破壞試驗(yàn)下注射用替加環(huán)素的HPLC色譜圖注:A.酸破壞試驗(yàn)，B.堿破壞試驗(yàn)，C.氧化破壞試驗(yàn)，D.高溫破壞試驗(yàn);1.替加環(huán)素

表1 三批供試品的測(cè)定結(jié)果(%)

3 討論

3.1 本品為氨基堿性化合物，文獻(xiàn)報(bào)道［3］，替加環(huán)素的初始反應(yīng)物米諾環(huán)素與主要合成中間體9-硝基米諾環(huán)素、9-氨基米諾環(huán)素的HPLC檢測(cè)方法均采用磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，加入少量乙二胺四乙酸二鈉或三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為6.0～6.4)-乙腈為流動(dòng)相，通過(guò)調(diào)整緩沖鹽溶液的pH值及緩沖鹽溶液-乙腈的比例，能較好地控制以上化合物的純度。一般情況下，流動(dòng)相中緩沖鹽溶液的最佳濃度范圍為0.01～0.1 mol/L。磷酸鹽緩沖液濃度增大，各峰保留時(shí)間延長(zhǎng)，考慮達(dá)到分離要求的情況下，盡量選擇低濃度緩沖鹽溶液，選擇0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液。由于本品為含氮堿性藥物，極性較大，易被色譜柱上活性硅醇基強(qiáng)吸附，造成色譜峰拖尾。此外，硅膠中的微量金屬可以導(dǎo)致硅羥基的酸性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致主峰拖尾;替加環(huán)素也易于與硅膠中微量的金屬離子螯合而不易洗脫，為了消除金屬離子的影響，從而使方法具有更好的耐用性，在流動(dòng)相中加入了少量的金屬螯合劑-0.002mol/L的EDTA二鈉。

3.2 實(shí)驗(yàn)中分別考察了 pH 7.0、pH 6.4和 pH 5.0的磷酸二氫鉀溶液-乙腈為流動(dòng)相。結(jié)果顯示，隨著流動(dòng)相中緩沖液pH值的提高，替加環(huán)素峰的保留時(shí)間增加，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度增加。當(dāng)緩沖液pH值為6.4時(shí)，主峰與各主要雜質(zhì)均達(dá)到良好分離，且保留時(shí)間適中。分別調(diào)節(jié)流動(dòng)相緩沖溶液的pH值為6.3、6.5、6.6，從而考察鹽溶液pH值對(duì)分離的影響，結(jié)果表明，緩沖溶液的pH值對(duì)各組分的保留時(shí)間及相互分離影響較大，故實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要嚴(yán)格控制緩沖溶液的pH值。

［1］ 王明華，王明貴.新型甘氨酰環(huán)素類抗生素-替加環(huán)素［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2006，6(5):350-355.

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