人臍帶間充質(zhì)干細胞在急性腎小管壞死模型犬的體內(nèi)分布及趨化性

李芳 胡祥 賈丹兵 趙紅梅 周燕妮 黨智杰

人臍帶間充質(zhì)干細胞在急性腎小管壞死模型犬的體內(nèi)分布及趨化性

李芳 胡祥 賈丹兵 趙紅梅 周燕妮 黨智杰

目的觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞在家犬急性腎小管壞死模型的體內(nèi)分布及歸巢。方法健康家犬18只隨機分為3組。模型1組：肌注新鮮配制的0.2﹪二氯化汞溶液7 ml/kg建立急性腎小管壞死模型，采用經(jīng)外周靜脈注射法輸注體外分離培養(yǎng)并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（ DAPI ）標記的人臍帶間充質(zhì)干細胞。模型2組：造模方法同模型1組，采用股動脈介入經(jīng)左腎動脈直接注射體外分離培養(yǎng)并用 DAPI 標記的人臍帶間充質(zhì)干細胞。對照組：健康家犬，采用股動脈介入經(jīng)左腎動脈直接注射體外分離培養(yǎng)并用 DAPI 標記的人臍帶間充質(zhì)干細胞。細胞輸注后48 h處死動物留取腎臟、心臟、肝臟和胰腺，光鏡及熒光顯微鏡下觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞植入實驗動物體內(nèi)后的分布及存活情況。結(jié)果（1）對照組腎臟未發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細胞存在，而模型1組及模型2組在家犬腎臟中均可觀察到人臍帶間充質(zhì)干細胞存在；（2）模型1組及模型2組家犬腎臟中均有人臍帶間充質(zhì)干細胞存在，而心臟、胰腺不存在或少量存在人臍帶間充質(zhì)干細胞。結(jié)論（1）人臍帶間充質(zhì)干細胞移植后可在急性腎小管壞死腎臟內(nèi)存活，對正常腎臟無影響；（2）對于急性腎小管壞死家犬，人臍帶間充質(zhì)干細胞選擇性存在于腎臟內(nèi)，對心臟、肝臟及胰腺無影響。

臍帶；間充質(zhì)干細胞移植；趨化性；急性腎小管壞死

急性腎功能衰竭（acute renal failure, ARF）是臨床常見的急重癥，在過去的幾十年里，盡管腎臟替代治療有了很大的發(fā)展，但ARF的發(fā)病率和死亡率一直居高不下。急性腎小管壞死（acute tubular necrosis, ATN）是 ARF 的最主要原因， ATN的修復(fù)直接關(guān)系到ARF的病程和預(yù)后。因此人們在不停地探索 ATN 發(fā)病及修復(fù)的機理，并試圖找到促進腎小管上皮修復(fù)的新方法。

近年來，隨著干細胞研究的不斷深入，干細胞治療方法為急性腎小管壞死患者帶來了新的希望。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的干細胞可以分化成腎小管上皮細胞，參與急性腎小管壞死的修復(fù)[1-2]；并有研究發(fā)現(xiàn)，在腎臟缺血再灌注（ischemia-reperfusion injury, I/R)損傷兔模型中，經(jīng)右腎動脈灌注移植兔自體骨髓干細胞，觀察其對 I/R 損傷腎功能的影響，發(fā)現(xiàn)骨髓干細胞移植能較早降低腎臟 I/R 損傷后血清肌酐（serum creatinine, SCr）和尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）水平，在一定程度上促進 I/R 損傷后腎功能修復(fù)[3]；外源性骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）能夠遷移、定居于缺血再灌注損傷后的腎組織中并分化為腎小管上皮細胞，從而恢復(fù)腎臟的組織結(jié)構(gòu)和功能[4]。人臍帶來源的 MSCs 作為一種新的 MSCs 的來源有著無法比擬的優(yōu)勢：來源廣泛、采集方便、無倫理法律限制、擴增迅速、免疫原性低、支持造血和多向分化等，有良好的應(yīng)用前景[5]。本實驗在已有研究基礎(chǔ)上，采用人臍帶 MSCs 作為研究對象，觀察其在急性腎小管壞死家犬體內(nèi)的分布及趨化性，為人臍帶 MSCs 應(yīng)用于臨床腎臟疾病的治療提供依據(jù)。

材料和方法

一、動物

健康家犬18只，體重15.0 ～ 20.0 kg，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

二、試劑與儀器

超凈工作臺（中國蘇凈集團安泰公司），0.2﹪二氯化汞溶液(姜堰市環(huán)球試劑廠)，IMDM 培養(yǎng)基(美國 Sigma 公司)，胎牛血清(美國 Sigma 公司)，4′，6-二乙酰基-2-苯基吲哚( DAPI )美國 Biotium 公司，人臍帶 MSCs (深圳市北科細胞工程研究所)，eclipseE400 型熒光顯微鏡( Nikon公司)，Olympus CX6光學(xué)顯微鏡，組織切片機 Leica 公司、德國 Sigma 3K18 型臺式離心機和SIEMENS 數(shù)字血管機( DSA )。

三、方法

（一）MSCs采集

DAPI 標記的人臍帶 MSCs 由深圳市北科細胞工程研究所提供。臍帶取自足月剖宮產(chǎn)健康孕婦。臍帶采集之前產(chǎn)婦需做艾滋病病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和支原體等檢測，全部合格后方可采集，采集經(jīng)家屬同意并已簽知情同意書。采集后 4℃ 保存，6 h 內(nèi)培養(yǎng)，細胞活力≥90﹪，病原菌排查未檢出細菌，細胞傳代培養(yǎng)至第4代時用 DAPI 標記后用于本實驗。先配制 DAPI 液：將無菌的 10 mg DAPI 溶于 200 ml 無血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基中，至終濃度 50 mg/L，避光備用。然后將臍帶 MSCs 鋪滿培養(yǎng)瓶80﹪以上時，消化離心，吸干細胞團上面的培養(yǎng)基，加入已配好的DAPI 液10 ml，37℃，5﹪CO2培養(yǎng)箱中孵育 40 min，D-Hank 液反復(fù)洗滌 7 次，以去除未結(jié)合的多余的 DAPI，再次離心收集細胞，用 l ml 無血清培養(yǎng)基稀釋至移植所需密度，放于冰浴中 1 h 之內(nèi)進行細胞移植。同時收集最后一次洗滌液，熒光顯微鏡下 370 nm 熒光激發(fā)波長觀察證實是否還有DAPI。

（二）實驗動物及分組

所有實驗動物均飼養(yǎng)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心無特定病原體( SPF )屏障環(huán)境。所有動物隨機編號，自由飲食，記錄體重。隨機分為3組：模型1組（6只）、模型 2 組（6只）和對照組（6只）。模型1組及模型 2 組家犬均采用 0.2﹪二氯化汞溶液按 7.0 ml/kg 體重劑量肌肉注射，建立急性腎衰竭模型。由于目前沒有狗的急性腎衰竭的診斷標準，我們采用了內(nèi)科學(xué)急性腎衰竭的定義，據(jù)此作為試驗中急性腎衰竭的診斷標準[6]。對照組家犬照常飼養(yǎng)。觀察動物一般情況及死亡情況。造模前及造模后24 、48及72 h分別采血進行血生化指標測定并留取尿液進行尿常規(guī)測定，通過血生化指標測定確定 ATN 模型建立成功，造模成功的實驗動物進入實驗，血肌酐的絕對值每日平均增加 44.2 μmol/L或 88.4 μmol/L；或在24 ～ 72 h內(nèi)血肌酐值相對增加25﹪ ～ 100﹪[6]。

（三）人臍帶 MSCs 移植

將造模成功的模型 1組家犬外周靜脈緩慢注射以5 ml DAPI標記的人臍帶 MSCs 懸液，細胞總數(shù)為1.5 × 107。將造模成功的模型 2 組和對照組家犬分別用 3﹪ 的異戊巴比妥鈉，按照 0.15 ml/100 g 體重的劑量靜脈麻醉。待麻醉起效后，將家犬仰位四肢固定于 X線下的平板上，于右腹股溝區(qū)切開皮膚，鈍性分離右股動脈，用充滿肝素鹽水的硬膜外麻醉導(dǎo)管于右股動脈插入，經(jīng)腹主動脈進入左腎動脈約0.3 ～ 0.5 cm，暫時壓閉腹主動脈，移植組經(jīng)導(dǎo)管緩慢注射 5 ml 臍帶 MSCs 懸液，細胞總數(shù)為1.5 × 107，右股動脈切口用無損傷縫合線吻合。所有家犬繼續(xù)喂養(yǎng) 48 h。

（四）移植細胞存活觀察

于細胞移植后48 h，處死動物，取出腎臟、心臟、肝臟和胰腺，PBS 液灌注洗滌，取組織置于中性甲醛(10﹪)固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色，普通光鏡檢查；并取組織用滴有生理鹽水的錫紙包裹于4℃保存下送檢，制成冰凍切片進行熒光顯微鏡觀察并攝片，觀察移植細胞的存活情況。每組每只動物隨機取 30 例免疫熒光照片，腎小球熒光強度為：（+）低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下可見則為1分；（+ +）低倍鏡下可見，高倍鏡下清晰可見為2分。以此類推，計算每組平均積分為平均熒光強度

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS11.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，免疫熒光強度以± s 表示，組間比較采用獨立樣本樣本 t 檢驗。以 P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

本實驗結(jié)果顯示：（1）對照組腎臟無人臍帶MSCs 存在，而模型 1 組及模型 2 組家犬腎臟中均有人臍帶 MSCs 存在，免疫熒光強度與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）；（2）模型 1 組及模型 2組家犬腎臟中均有人臍帶 MSCs 存在于腎小管細胞，而心臟、肺臟、胰腺不存在或少量存在人臍帶 MSCs。

一、每組腎臟病理標本（圖1 ～ 3）

經(jīng)HE染色模型1組顯示腎小管出現(xiàn)空泡變性和顆粒變性，模型2組顯示腎小管出現(xiàn)空泡變性和顆粒變性，對照組顯示正常腎臟組織。

二、每組腎臟免疫熒光標本（圖4 ～ 6）

移植術(shù)后對照組腎臟幾乎無熒光顯影，模型1組和模型2組腎小管中均可見綠色熒光。

圖1 模型 1 組 HE 染色（×200）

圖2 模型 2 組 HE 染色（×200）

圖3 對照組 HE 染色（×200）

圖4 對照組移植后腎臟（×40）

圖5 模型 1 組移植后腎臟（×40）

圖6 模型 2 組移植后腎臟（×40）

三、模型 1 組及模型 2 組人臍帶 MSCs 移植后心臟、肝臟和胰腺免疫熒光標本（圖7 ～ 12）移植術(shù)后模型1組和模型2組顯示心臟及胰腺幾乎無熒光顯影，肝臟無熒光顯影。

圖7 模型 1 組移植后心臟（×40）

圖8 模型 2 組移植后心臟（×40）

圖9 模型 1 組移植后肝臟（×40）

圖10 模型 2 組移植后肝臟（×40）

圖11 模型 1 組移植后胰腺（×40）

圖12 模型 2 組移植后胰腺 （×40）

四、人臍帶 MSCs 移植后腎臟免疫熒光強度的比較

人臍帶血MSCs移植后腎臟免疫熒光強度測定結(jié)果見表1，模型組1、模型組2分別與對照組比較,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

表1 人臍帶 MSCs 移植后腎臟免疫熒光強度的比較

討 論

引起 ATN 腎毒性原因包括部分抗生素、化學(xué)毒物、重金屬、造影劑和高濃度的內(nèi)源性毒素。腎功能的恢復(fù)依賴于腎小管上皮細胞的再生[7-9]。傳統(tǒng)的觀念認為，腎小管損傷后，新生小管上皮來源于殘存腎小管上皮細胞或腎間質(zhì)來源的肌纖維母細胞[10]。一旦發(fā)生腎小管壞死就只能采用血液凈化部分替代腎臟工作，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以等待腎小管上皮的自我修復(fù)，如能發(fā)現(xiàn)加速腎組織修復(fù)的藥物或方法，無疑能縮短急性腎衰病程，早期恢復(fù)機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，減少因腎衰導(dǎo)致的并發(fā)癥，從而減少病死率。

干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，其處于未定向分化狀態(tài)并具有增殖能力。在特定條件下，干細胞可以分化成不同類型的具有特征性形態(tài)、特異分子標志和特殊功能的成熟細胞。干細胞按來源可分為胚胎干細胞（embryonic stem cells, ESCs）[11]和成體干細胞（adult stem cells, ASCs）[12-13]。胚胎干細胞雖然具有分化的全能性，但由于存在倫理學(xué)、免疫排斥以及等問題限制了它在臨床上的應(yīng)用。成體干細胞是存在于人和哺乳動物組織中的具有多向分化潛能的一類細胞，目前許多成體組織（如骨髓、軟骨、血液、神經(jīng)、肌肉、脂肪、皮膚、肝臟和胰腺等）中均有發(fā)現(xiàn)。其中，骨髓 MSCs 是實驗和臨床研究中 MSCs 的主要來源，但骨髓存在有自身局限性。骨髓干細胞取材不易，供體有限，而且骨髓來源的 MSCs 細胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，供體在抽取骨髓時病毒感染率較高[14]。

近年研究報道臍帶中富含 MSCs，易于獲得，分離成功率高，具有多向分化的能力，漸成為研究的熱點。臍帶 MSCs 與骨髓 MSCs 相比較有很多優(yōu)勢，如取材方便，來源廣泛，易于收集、保存和冷凍，不受倫理、道德及法律方面的爭論與限制[15-16]；相對純凈，與干細胞輸注相關(guān)的病毒和病原微生物感染率遠低于骨髓移植[17]；人臍帶 MSCs 含量豐富，較為原始，分化能力強，可在體外進行分離、培養(yǎng)，擴增迅速，且生物性能穩(wěn)定，多次傳代擴增仍能保持旺盛功能[18]，可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源；人臍帶 MSCs 不表達或低表達免疫排斥相關(guān)標記，這是骨髓與臍帶MSCs 的共同特點，免疫原性低，是一類低免疫原性細胞，不須經(jīng)過嚴格配對使用，異體及異種移植無免疫排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱，適宜于不同個體之間的移植。因此本實驗選擇臍帶 MSCs 作為研究對象。

本實驗將人臍帶 MSCs 分別移植給健康家犬及急性腎小管壞死模型家犬，結(jié)果顯示健康家犬腎臟無人臍帶 MSCs 存在；對于急性腎小管壞死家犬，人臍帶 MSCs 選擇性存在于腎臟內(nèi)，對心臟、肝臟及胰腺無影響。說明人臍帶 MSCs 移植到受試動物體內(nèi)后，有明顯的趨化性，選擇性存在于受損臟器內(nèi)。已有研究表明，MSCs 在體內(nèi)可定向分化成腎小管上皮細胞或MSCs 通過促進腎臟局部自分泌和旁分泌生長因子、抗炎因子和抑制炎性因子等，促進腎臟固有的祖細胞向腎小管上皮細胞分化，及存活的 MSCs 向腎小管上皮細胞分化等，以促進損傷腎小管上皮細胞的修復(fù)[19-21]，而對正常臟器組織無影響。本實驗可為臨床人臍帶 MSCs 在急性腎損傷治療中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)，其具體的治療作用會繼續(xù)進行研究，人臍帶 MSCs 可能會因為其來源廣泛、安全和有效等優(yōu)點而成為一種新的腎臟疾病的替代療法。

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Distribution of human umbilical cord mesenchymal stem cells in dogs with acute tubular necrosis

LI Fang*, HU Xiang, JIA Dan-bing, ZHAO Hong-mei, ZHOU Yan-ni, DANG Zhi-jie.*The 211 Hospital of PLA, Haerbin 150060, China

LI Fang, E-mail: weizhaohongmei@163.com

Objective To observe the distribution of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in the dogs with acute tubular necrosis (ATN ).MethodsDog ATN model was established by intramuscularly injecting freshly prepared 0.2﹪ HgCl2, 7 mg/kg. Human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were cultured and labeled with DAPI. In the experimental groups, cells were injected either through peripheral vein or left renal artery by transfemoral coronary intervention. Control group received mesenchymal stem cells only through the left renal artery by transfemoral coronary intervention. 48 hours later, all dogs were killed and the specimens from kidneys, hearts, livers, and pancreas were collected. The distribution of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the body, especially in the kidney, was observed by lightmicroscope and fl uorescence microscope.ResultsThe human umbilical cord mesenchymal stem cells were found in the kidneys of experimental groups, but not in the hearts, livers and pancreases. In the control group, no human umbilical cord mesenchymal stem cells were found in any of these organs.ConclusionThe injected human umbilical cord mesenchymal stem cells could be attracted to the ATN dogs’ kidneys, which indicates that local cues are important for stem cell homing.

Umbilical；Mesenchymal stem cells transplantation；Chemo taxis；Acute tubular necrosis

2011-01-04）

（本文編輯:蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2011.01.004

150086 哈爾濱，解放軍第二一一醫(yī)院（李芳、賈丹兵、趙紅梅、周燕妮、黨智杰）；深圳市北科細胞工程研究所（胡祥）

李芳，E-mail：weizhaohongmei@163.com

李芳, 胡祥, 賈丹兵, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細胞在急性腎小管壞死模型犬的體內(nèi)分布及趨化性[J/CD]. 中華細胞與干細胞雜志: 電子版, 2011, 1(1): 31-38.