航天誘變菌株黑曲霉ZM-8降解小麥秸稈產纖維素酶條件的優化

天水師范學院生命科學與化學院 馬旭光 張宗舟

利用微生物酶解法預處理纖維素資源與傳統的物理處理法、化學處理法相比，具有節約能源、反應條件溫和、副產物少或無副產物、無環境污染等優點。微生物產生的纖維素酶對纖維素的降解是一個復雜的生物化學過程，受原料成分、培養溫度、培養pH值、培養時間等眾多因素的影響（蔣芳等，2006；徐昶等，2005；王景林等，2000）。因此，在具有性價比較高的纖維素酶產生菌株的基礎上，優化其分泌纖維素酶的各種條件就顯得至關重要。

本試驗在前期已確定影響黑曲霉ZM-8在小麥秸稈為主要原料產纖維素酶的單因素研究基礎上（馬旭光等，2008），應用正交試驗對各單因素進行優化，以期為提高農作物秸稈的利用效率、拓寬其飼用范圍提供可靠的工藝參數。

1 試驗材料

1.1 菌種 航天誘變黑曲霉 （Aspergillus niger）突變株ZM-8（馬旭光等，2007），保存于PDA斜面培養基。

1.2 發酵主要原料 小麥秸稈粉 （過40目篩），麩皮（市售）。

1.3 試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 DNS試劑，檸檬酸緩沖液，水楊素（Sigma），羧甲基纖維素鈉，新華定性濾紙，其他均為國產的化學純或分析純。

1.3.2 主要儀器 恒溫培養箱；高速冷凍離心機；722型分光光度計；恒溫水浴鍋等。

1.4 培養基

1.4.1 種子培養基 小麥秸稈粉10 g，營養液[（2% （NH4）2SO4，0.08%MgSO4·7HO2，0.04%KH2PO4）]25 mL。

1.4.2 固體產酶培養基 小麥秸稈粉6g，麩皮4g，營養液[（2.0%（NH4）2SO4，0.08%MgSO4·7HO2，0.04%KH2PO4）]25mL。

上述培養基均需在 1.0×105Pa，121℃滅菌30 min，pH 值自然。

2 試驗方法

2.1 產酶培養基組分的優化 在前期單因素研究中發現，發酵培養中的麩皮添加量、氮源、含氮量以及水料比等都會不同程度地影響酶活力 （馬旭光等，2008）。 本試驗采用 L16（44）正交試驗設計的方法對產酶培養基組分優化，試驗因素水平見表1。

表1 產酶培養基正交試驗因素水平

2.2 產酶培養條件的優化 前期的單因素研究表明，培養時間、溫度、初始pH值和接種量都會對酶活有不同的影響（馬旭光等，2008）。本試驗均采用L16（44）正交試驗設計方法進行發酵環境條件的優化，試驗因素水平表見表2。

表2 產酶培養條件正交試驗因素水平

2.3 復證 在已確定的最佳培養基組分和培養條件下測定酶活，并與在未優化培養基上的酶活力進行比較，以驗證優化效果。

3 測定方法

3.1 發酵方法 將黑曲霉ZM-8的斜面孢子用無菌生理鹽水洗脫，制成孢子懸浮液 （106～107個/mL），按10%（V/m）的接種量接入種子培養基中，28℃恒溫培養72 h，待菌絲生長旺盛、孢子叢生時即可放入冰箱保存，供種曲備用。然后將制備的種曲按一定比例接入固體產酶培養基進行培養，28℃恒溫培養72 h后取樣測定酶活。

3.2 粗酶液的制備 取生長良好的固體發酵曲5 g，加水 50 mL，于 30℃保溫 1 h，用沙芯漏斗過濾，然后在轉速10000 r/min冷凍離心機上離心10 min，提取上清液定容至 100 mL，得 1∶20粗酶液。

3.3 酶活力的測定

3.3.1 FPU酶（濾紙酶）活力的測定 取適當稀釋的酶液0.5 mL，加入50 mg濾紙條 （約1 cm×6 cm）和1.5 mL 0.05 mol/L的緩沖液，并向對照試管中加入1.5 mLDNS溶液以鈍化酶活性，然后在50℃保溫1 h，取出后立即向待測試管中加入1.5 mLDNS溶液以中止酶反應，充分搖勻后沸水浴5 min，冷卻后在540 nm的波長下測定其光密度值。

3.3.2 CMC酶（內切酶）活力的測定 加入的底物為1.5 mL 0.51%CMC緩沖液，在50℃水浴中保溫0.5 h，其余操作同3.3.1。

3.3.3 纖維素酶活力單位定義 在50℃，pH 4.8，恒溫30 min條件下以水解反應中每小時由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）（鄔敏辰等，1997）。 計算公式為：

式中：5.56為1 mg葡萄糖的μmol數（1000/180=5.56）。

樣品重為發酵后的固體干曲重量。

3.3.4 數據分析及處理方法 參考李春喜等（2000）對正交試驗所得數據利用DPS軟件進行極差分析。

4 結果與分析

4.1 產酶培養基組分的優化結果 結果見表3。

由表3可知，各因素對FPU酶活力的影響大小順序為 A（含氮量）、B（氮源）、D（麩皮加入量）、C（加水量）。其最佳的產酶培養基組成為A3B2D2C2，即含氮量1.0%、氮源為碳酸銨、小麥秸稈與麩皮之比4∶1、料水比為1∶2。 對CMC酶活力的影響大小順序為 B（氮源）、C（加水量）、A（含氮量）、D（麩皮加入量）。其最佳的產酶培養基成分為：B2C2A4D2，即：氮源為碳酸銨，料水比為 1∶2，含氮量為1.4%，小麥秸稈粉與麩皮之比4∶1。

表3 產酶培養基組分的正交試驗極差分析

FPU是表征纖維素酶系中各組分酶之間的協同作用（徐昶等，2005），而CMC酶活代表外切β-1，4葡聚糖酶活力和內切酶活力的總和 （孔健，2005），再根據各因素對纖維素酶的影響大小，最終將產酶培養基確定為：氮源為碳酸銨、料水比為1∶2、含氮量 1.4%、秸稈粉與麩皮之比為 4∶1。

4.2 產酶培養條件的優化結果 結果見表4。

由表4可知，其FPU酶較佳產酶條件為A3B3D1C4，即：培養溫度為 32 ℃，pH 值為 6.5，接種量為4%，培養時間為96 h。CMC酶的較佳產酶條件為A2C3B3D1，即：培養溫度為28℃，pH值為6.5，接種量為4%。培養時間為72 h，培養溫度和培養時間是影響CMC產酶的主要因素；培養溫度對FPU的影響大于pH值和培養時間，其極差小于CMC酶；培養時間對FPU的影響較大，其極差遠大于CMC酶；pH值和接種量對兩種酶活的影響都不明顯。綜合上述分析，可將黑曲霉產酶的最佳條件確定為：C4A2B3D1。

表4 產酶培養條件的正交試驗極差分析

4.3 復證 在已確定的最佳培養基組分和培養條件下測定酶活，即培養基配方：氮源為碳酸銨，含氮量1.4%、料水比為1∶2、小麥秸稈粉與麩皮之比為4∶1；培養條件：培養溫度為28℃、培養時間為96 h、初始pH值為6.5、接種量為4%。測定結果表明：FPU和CMC的酶活分別為6.57 U/g和22.38 U/g。

5 小結

5.1 含氮量和加水量是影響產酶的最主要因素，其產酶培養基組分的最優組合為：最佳氮源為碳酸銨，含氮量1.4%，料水比為1∶2，小麥秸稈粉與麩皮之比為 4∶1。

5.2 培養時間和培養溫度是影響產酶的最主要環境因子，其產酶的最佳培養條件為：培養溫度為28℃，培養時間為 96 h，pH值為6.5，接種量4%。

5.3 在優化的培養基配方和培養條件下，其FPU和CMC的酶活分別為6.57 U/g和22.38 U/g。

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