產β-甘露聚糖酶環狀芽孢桿菌發酵罐放大工藝研究

北京農業職業學院 楊新建 段素云

β-甘露聚糖酶 （β-l，4-D-mannan mannanohydrolase，EC.3.2.l.78）是一種降解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈β-l，4-D-甘露吡喃糖的酶。它在分解飼料中的聚糖（除去抗營養的不良作用）、促進動物腸道內有益菌群的繁殖、促進營養的消化和吸收；以及通過內分泌和免疫的途徑提高營養成分 （特別是能量）的利用率、改善動物的健康狀況、提高動物的生產水平等方面具有不可替代的作用。

目前，國內外β-甘露聚糖酶的研究非常活躍，取得的成果也頗為顯著（孫占斌和張暉，2009；唐犖等，2010；殷瑩瑩等，2009）。但是這些成果大多局限于實驗室的搖瓶發酵，而搖瓶實驗難以精確描述微生物代謝過程的計量學和動力學，并且傳遞因素造成的影響難以精確在線檢測和調控，所以采用發酵罐進行發酵實驗仍是目前生物技術開發和實驗產業化的必由之路。

本試驗通過搖瓶正交設計獲得的環狀芽孢桿菌WXY-100產β-甘露聚糖酶最優培養基配方的基礎上（楊新建等，2006），研究50 L全自動發酵罐發酵過程中一些操作條件的變化比如更換碳源、加入誘導劑、誘導劑量、補料、下罐時間等對發酵過程的影響，從而為今后的放大生產提供可借鑒工程參數和菌種性能參考。

1 試驗材料

1.1 菌種 由本實驗室篩選并保存的環狀芽孢桿菌WXY-100。

1.2 儀器設備 50 L全自動發酵罐、普通搖床SHK-99-Ⅱ、分光光度計、恒溫水浴鍋、電磁加熱鍋SR-1670A、離心機5804R型、恒溫培養箱420BS等。

1.3 培養基 固體培養基：NaCl 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，胰蛋白酶胨 10 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 7.0。一級種子培養基：NaCl 10g/L，酵母提取物5 g/L，胰蛋白酶胨10g/L，pH 7.2，高壓滅菌后備用。二級種子培養基：酵母提取物10 g/L、甘油7.5 g/L、（NH4）2SO41 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.5。

發酵培養基：酵母提取物20 g/L、甘油20 g/L、（NH4）2SO42 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L，玉米漿 5 g/L，pH 7.5。

補料培養基：30%葡萄糖、5%胰蛋白胨。

2 試驗方法

2.1 菌種活化 將冷藏保存的菌種經一定的倍比稀釋后分區劃線或涂布在固體培養板上，37℃倒置培養過夜。挑取單個環狀芽孢桿菌菌落于盛有一級種子培養基的三角瓶中，35℃振搖培養（200 r/min）至對數生長期末 （根據生長曲線確定），作為一級種子液。

按照6%的接種量，將一級種子液接種到二級種子培養基中，35℃振搖培養至對數生長期末（根據生長曲線確定具體時間），作為二級種子液，該級種子作為接種發酵罐的種子。

2.2 酶活性檢測 發酵液于8000 g/min條件下離心20 min，取上清（粗酶液），據DNS法進行酶活測定。

2.3 發酵工藝優化

2.3.1 碳源的更換對發酵的影響 根據實際的發酵過程，將發酵培養基中的碳源摩芋粉更換為甘油，比較二者在酶活性、發酵時間等各個方面的優劣。

2.3.2 誘導劑劑量的確定 在菌體生長的對數生長期末，分別加入0%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的誘導劑（瓜爾豆膠），根據最終的酶活性大小確定最佳的誘導劑量 （Seiji Yoshida等，1998）。

2.3.3 純氧的攝入對產酶的影響 在對數生長期后半段，通過加入純氧來調節溶氧的大小，根據下罐的發酵液的酶活性大小來確定加入純氧的必要性。

2.3.4 pH值的變化對產酶的影響 針對實際過程，設計下面三種情況：一是整個發酵過程pH值不發生變化為7.0；二是發酵過程中，菌體生長階段pH值不發生變化為7.0，到對數生長期末（誘導點）升高pH值為7.5；三是整個發酵過程pH值不發生變化為7.5。根據最終酶活性高低確定最佳的pH變化過程。

2.3.5 補料對產酶的影響 根據溶氧判斷菌體對養分的消耗情況，采用流加的方式進行補料，根據最終的酶活性大小來確定補料的作用。

2.3.6 發酵終點的確定 分別取誘導后各個時間點的發酵液，進行酶活性測定，以確定最高產酶點，也即是發酵液下罐時間。

3 試驗結果

3.1 碳源的更換對發酵的影響 分別以摩芋粉、甘油作為碳源進行發酵罐發酵，結果見表1。

表1 不同碳源相應數據的比較

上述結果顯示，以魔芋粉為碳源只在最高酶活性方面優于甘油，但在性價比方面卻以甘油為佳，因此在發酵罐放大試驗中，發酵培養基的碳源改為甘油。

3.2 誘導劑劑量的確定 在細菌生長期階段，加入0.05%的瓜爾豆膠2～3次，在對數生長期末（根據溶氧判斷），分別加入0%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的瓜爾豆膠，酶活性大小比較見圖1。由圖1可以看出，當誘導劑的加入量為0.5%時，酶活相對最高。

圖1 不同劑量誘導劑對產酶的影響

3.3 純氧的攝入與否對產酶的影響 在發酵的開始階段，主要以改變攪拌速度來控制溶氧，純氧的攝入主要在攪拌速度不能有效控制溶氧之后（對數生長期后2 h左右），具體見表2。結果顯示，對數生長期后半段，在改變攪拌速度不能有效提供充足溶氧的情況下加入純氧，不但能加快菌體的生長和繁殖，還能夠提高菌體最終的產酶效率。

3.4 pH值的變化對產酶的影響 根據最終的酶活性大小，三種情況的比較見圖2。

表2 純氧的攝入對產酶的影響

結果顯示，第二組，也就是發酵過程中，菌體生長階段pH值不發生變化為7.0，到對數生長期末（誘導點）升高pH值為7.5的情況下，酶活相對較高。

圖2 pH值的變化對產酶的影響

3.5 補料對產酶的影響 在對數生長期末，養分消耗殆盡（至少碳、氮源消耗完畢），此時流加補料培養基。最終結果顯示，酶活性并沒有質的提高，還是在5×105U/L左右。

3.6 發酵終點的確定 選取誘導劑劑量為0.4%和0.3%的兩次發酵過程作為研究對象，測量其誘導后各個時間段的酶活性大小，結果見圖3。

圖3 誘導后各個時間段的酶活性大小

結果顯示，在誘導后4～5 h為最佳下罐時間點，此時酶活最高。

4 討論

4.1 碳源的更換對發酵的影響 之所以在發酵放大階段更換碳源，在于含有2%的摩芋粉的發酵培養基，高壓滅菌之后黏稠度很大，占據了大量的水分，使發酵罐內的溶氧一直處于很低的狀態，而目的菌（環狀芽孢桿菌）是一種喜氧菌，其生長過程需要大量的氧，如果系統供氧不足或者溶氧在其臨界氧之下，將嚴重影響該菌的生長繁殖及其代謝產物的生成。另外根據3.1的結果，以摩芋粉為碳源，菌體有一個很長的延滯期，生長過程也比較漫長，整個過程更是長達33 h，最終也影響到酶活。在此情況下，考慮到碳分解代謝物阻礙效應，選擇了甘油作為發酵罐放大實驗中發酵培養基的碳源 （其他聚糖也與摩芋粉一樣存在上述問題）。而甘油能與水互溶，這樣就釋放了大量的水，可以保證在菌體生長的初始階段獲得足夠的氧。從結果來看，這樣不但縮短了發酵的時間，從性價比上也要比摩芋粉作為碳源高。由于目的產物β-甘露聚糖酶是一種誘導酶，所以當以甘油為碳源的時候，需加入一種聚糖作為誘導劑以誘導β-甘露聚糖酶的產生。

4.2 誘導劑對酶活的影響 β-甘露聚糖酶是一種誘導酶，其誘導劑選擇了可以作為其基質的聚糖瓜爾豆膠。對于其劑量的確定，采用比較簡單的酶比活來進行直接的定量。實驗結果表明，以0.5%為最佳的誘導劑量，同時，在對數生長期間加入2～3次的劑量為0.05%的誘導劑，可以加強對數生長期末的誘導效果。

4.3 純氧的攝入對產酶的影響 實際的發酵過程中，通氣量在整個發酵過程中是不變的，在菌體對數生長期前半段主要通過控制轉速來調節溶氧，開始轉速每提高100 r/min，溶氧可以從30%提高到80%左右，但到500 r/min之后，再提高轉速溶氧變化不大，并且溶氧處在臨界氧（30%）之下，這將嚴重影響菌體的生長繁殖和代謝產物的合成。鑒于此，當轉速提高到500 r/min之后，采用加入純氧的形式來保證菌體的氧氣需要 （使溶液的溶氧達到80%左右），直至達到對數生長期末（溶氧值突然上升，并超過100%）。此后加入誘導劑，并維持至下罐結束。

從實際的結果看，純氧的攝入彌補了由于溶氧不足引起的菌體生長緩慢的情況，并能提高最終酶的活性。

4.4 pH值的變化對產酶的影響 對于微生物來講，適合其生長的pH值不一定是其產物合成時期的最適pH值，因此實際的發酵過程中，在菌體的不同階段要提供其合適的pH值。相反，不合適的pH值會影響各種酶活、菌體對基質的利用速率和細胞的代謝，從而影響菌體的生長和產物的合成。對于本實驗目的菌，其最適生長pH值為7.0，而在菌體生長階段，由于產生大量的酸，溶液pH值下降很快，此時通過加入堿液（NaOH或者氨水）來調節其在7.0左右，以維持菌體正常生長。到對數生長期末時，菌體進入生產期，根據前期的研究結果 （楊新建等，2006），此時提高溶液pH值為7.5，以利于目的產物的合成。在產物合成后期，溶液的pH值會因為菌體的衰亡而升高，此時需要加入相應的酸液來控制pH值穩定在7.5，因為過高的pH值會降低最終目的產物的活性。實際結果顯示，在菌體生長期和生產期提供不同的適合的pH值，對目的產物的合成有一定的促進作用。

4.5 補料對產酶的影響 補料的結果不理想，其原因很可能是多方面的。首先，補入的是葡萄糖，而發酵培養基的碳源為甘油，同時葡萄糖還可能存在碳分解代謝阻礙；其次，補料的時間以及補料的方式，還有待研究。在一般的情況之下，如果補料的時機和方式把握準確，相應的結果都要比不補的情況好，而本結果卻與之相反，因此，今后要加強這方面研究，將其作為提高酶活的一個突破點。

4.6 發酵終點的判斷 發酵終點也即是下罐時間，發酵的目的就是要得到比較高的酶活性，就是單位體積內產物量最多，因此在單位體積內酶活性最高點結束發酵。

對于不同的發酵類型以及發酵目的，發酵終點判斷標準有所不同。如提高產率，就要縮短發酵時間；如要提高產物濃度，就要延長發酵時間。發酵終點的選擇對下游工序有很大的影響，下罐時間過早，會殘留過多的養分（如糖、脂肪、可溶性蛋白等），增加提取工序的負擔（這些物質的乳化作用會干擾樹脂的交換）；下罐時間過晚，菌體自溶，不僅會延長過濾時間，還可能使一些不穩定的產物濃度下跌，擾亂提取工序的作業計劃。

5 小結

以環狀芽孢桿菌WXY-100為研究對象，研究了該菌在50 L全自動發酵罐中更換C源、誘導劑量、純氧的攝入、pH值的變化、補料、下罐時間等條件對發酵過程的影響。結果表明，發酵培養基的碳源改為甘油，在對數生長期末加入0.5%的誘導劑，對數生長期后半段攝入純氧，對數生長期末（誘導點）將pH值從7.0升高為7.5，酶活相對較高；并在誘導后4～5 h為最佳下罐時間點；而補料的效果不明顯。

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