飼料中四環素類抗生素的放射免疫分析

成都市產品質量監督檢驗院 周 浩 李俊霞 楊 紅 肖全偉

四環素類是由鏈霉菌產生的一類廣譜抗生素，主要包括四環素、土霉素、金霉素等，由于具備抗菌譜廣以及價格低廉等優點，已被廣泛應用于畜禽、水生動物和蜜蜂養殖中（賈久滿等，2007）。四環素類抗生素對于呼吸道和消化道疾病有很好的預防作用，促進生長作用效果較好，但容易被消化道吸收而殘留在畜禽產品中，因此會嚴重危及人類的身體健康。四環素類藥物的毒性反應主要表現在對胃、腸、肝臟、腎臟的損害以及對牙齒和骨骼的破壞，最顯著的殘留毒性是誘導耐藥菌株的產生（李俊所等，2002）。目前四環素類抗生素的檢測方法有微生物法、酶聯免疫方法、高效液相色譜法和質譜聯用法 （閆小峰，2010；杜紅鴿等，2008；王晶等，2002）等，雖然這些方法都準確可靠，但成本昂貴，前處理繁瑣復雜，檢測時間較長，無法縮短陰性樣品的檢測時間，遠不能滿足大批量樣品快速檢測的需要；放射免疫法結合了微生物法的準確與免疫法的高效，可用來快速篩選飼料中四環素族藥物殘留。本實驗旨在建立一種可靠、特異性強的放射免疫法用于飼料中四環素類抗生素的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 設備與材料

1.1.1 儀器和設備 Charm II 7600分析儀，渦旋振蕩器，電熱恒溫器，專用硼硅玻璃試管及試管塞，精密pH試紙（5.0～10.0），離心機，微量移液器等。

1.1.2 試劑 四環素類抗生素檢測試劑盒及閃爍液，提取緩沖溶液，多抗標準品，緩沖液M2、陰性組織提取物，以上試劑均由Charm公司試劑盒提供。

四環素類藥物標準品：四環素、土霉素、金霉素、氯霉素、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、青霉素G等標準品，以上標準品均購于Sigma公司。

1.1.3 試驗樣品 市場購買飼料20組，四環素類抗生素留檢陽性樣品10組及陰性樣品40組。

1.2 方法

1.2.1 測試原理 放射免疫原理基于兩個方面，其一：每類抗生素族均是在一個母環基礎上用不同的功能團修飾形成特定功效的抗生素。其二：微生物細胞表面都存在著能與抗生素功能基團結合的特異受體（王晶等，2002）。因此該法測定的基礎是競爭性受體免疫反應，使用兩種試劑:一種是被[3H］標記的四環素，另一種是四環素藥物結合試劑（微生物細胞上的特異性受體）。當樣品中含有四環素類抗生素殘留時，殘留物與結合試劑受體上的結合位點結合，從而阻止了[3H］標記的四環素與結合位點的結合。[3H］標記的四環素結合越多，則樣品中四環素類抗生素殘留越少。用液體閃爍計數儀測定樣品中的[3H］的（每分鐘脈沖數）[cpm]值，cpm值越大，樣品中的四環素類抗生素殘留量越低（陸勤等，2007；鄭晶等，2005）。

1.2.2 樣品處理 稱取1 g飼料于帶蓋樣品管，做好標記；加10 mL MSU提取緩沖液至樣品管中，旋渦振蕩15 s。用pH試紙測試pH值，滴加M2緩沖液，直到將pH值調至7.5，此液為待測液。

1.2.3 測定步驟 取出檢測試劑盒，用壓桿將白色藥片（微生物受體）推出到空的試管中；用加液器取300 μL溫水至管中，用旋渦振蕩混合10 s將藥片打碎；用移液器加5 mL樣品，接著將橙色藥片（[3H］標記的四環素抗體）推至試管中；用混合器混合15 s；在36℃的孵育器孵育5 min；將離心機調至4000 r/min離心5 min；立即小心棄去上清液，將測試管邊緣的水珠擦干；加300 μL溫水，用旋渦振蕩混合10 s將沉淀物打碎；加3 mL閃爍液至試管中，加蓋，混勻，靜置1 min。在CharmⅡ7600分析儀的[3H］頻道進行60 s計數，將測得結果與控制點比較，如果樣品cpm值大于控制點，則判為陰性；如果樣品cpm值小于或等于控制點，應判定為初篩陽性。

1.2.4 控制點的確定 首先用LC-MS方法確定6組飼料中四環素類殘留陰性樣品，選陰性樣品加標濃度為50 μg/kg作為控制點。在6份陰性樣品中分別加入標準溶液，形成樣品中四環素類含量50 μg/kg，用1.2.2方法進行提取后，按照1.2.3的步驟進行測定，得出6個cpm值，計算其平均值。考慮提取過程中的回收以及防止假陰性出現，因此控制點的cpm值確定在平均值的基礎上上調15%，即控制點cpm 值＝平均值×（1＋15%）。

1.2.5 陽性結果的確定 當樣品cpm值小于控制點cpm值時，應首先同時測定一個陰性質控和一個陽性質控，測試的陽性質控應該小于控制點，以確定試劑和設備工作正常，再重新平行取樣檢測。如果重測樣品的cpm小于控制點，且試劑和設備正常，則判定樣品初篩陽性。改用LC-MS法進行確定。

1.2.6 交叉反應 分別將氯霉素、環丙沙星、鏈霉素、青霉素G、阿莫西林、磺胺嘧啶、紅霉素、螺旋霉素標準儲備液，添加到陰性樣品中，配成含單一抗生素以及多種抗生素濃度為1000 μg/kg的飼料樣品，樣品處理及檢測方法同1.2.2和1.2.3。

2 結果與分析

2.1 標準曲線 將金霉素標準品添加入四環素陰性飼料樣品中，使飼料的金霉素添加濃度分別為 20、50、80、100、150、200、250、300、350、400 μg/kg，按1.2.3中測定步驟檢測其cpm值，結果見表1。

由于在CharmⅡ放射免疫分析中作為受體的細菌和被[3H］標記的抗原的量是固定的，因此當樣品中競爭性抗原濃度增加時其競爭效率下降，Δcpm逐漸減少。

表1 金霉素添加濃度與cpm值的關系

2.2 加標實驗 用50 μg/kg篩選水平，分別空白添加四環素、土霉素、金霉素以及它們混合標準，混標 1：土霉素∶四環素∶金霉素=4∶3∶3，混標 2：四環素∶土霉素∶金霉素=4∶3∶3，混標 3：金霉素∶土霉素∶四環素=4∶3∶3。 結果見表 2。

表2 篩選水平50 μg/kg的樣品加標實驗陽性檢出率 %

從表2可以看出，無論是單標還是混標，在50 μg/kg篩選水平實驗中結果均為陽性。

2.3 比對實驗 在對用LC-MS法檢測結束的50組留檢樣品，其中四環素類（總量大于50 μg/kg）陽性留檢樣品10組及陰性樣品40組，用放射免疫法分析，結果見表3。

2.4 應用檢測 以50 μg/kg作為篩選濃度，對20組市場購買的飼料進行篩選，其結果見表4。

表3 放射免疫法與LC-MS法對50組樣品分析符合情況

表4 飼料中四環素類抗生素殘留測定

用LC-MS方法驗證5、10、18號樣品的四環素類殘留總量結果分別為 161.4、70.5、284.1 μg/kg；同時驗證其余陰性樣品，測定結果均小于50 μg/kg。表明應用情況良好，篩選結果可靠。

2.5 交叉反應 經過多次反復對1.2.6中其他族抗生素加標試驗，與控制點cpm值進行比較，結果均為陰性。表明CharmⅡ四環素類抗生素放射免疫檢測法特異性強，與本族以外的抗生素無交叉反應。

3 小結

目前在日常檢測中陽性樣品很少，因此檢測發展的趨勢是快速區分陽性與陰性樣品。CharmⅡ放射免疫分析法是結合微生物學與免疫學各自的特點發展起來的。放射免疫檢測法具有操作簡單、速度快、分析成本低的優點，是目前使用最廣泛、快速、靈敏的檢測抗生素殘留的方法，該法適用于大量樣品的篩選。飼料樣品前處理簡單、干擾因素小，只需簡單處理便可檢測，從接收樣品到出結果，整個過程大約20 min。陰性結果不但表明該樣品中含四環素族單種抗生素濃度分別小于50 μg/kg，同時也可表明，四環素族濃度總和不超過50 μg/kg。所以，CharmⅡ放射免疫法提供了一種很好的飼料中多種四環素類藥物檢測的快速篩選方法。

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