骨髓間充質干細胞治療兔膝RA模型軟骨損傷的MRI評價

周鐘珩，崔延安，劉 釗，劉紅霞，黃海青，張全彬

（1.江蘇省中醫院MR室，江蘇 南京 210029；2.南京醫科大學附屬南京第一醫院骨科中心，江蘇 南京 210006）

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其基本病理特征是滑膜組織炎性增生伴關節軟骨和骨組織的破壞。前期研究中已證實MRI能夠評價RA的滑膜增厚和軟骨的破壞情況[1]。骨髓間充質干細胞（BMSCs）具有多向分化潛能，在特定條件下可分化為軟骨細胞。本實驗主要利用MRI觀察BMSCs治療兔膝RA模型后關節軟骨的前后變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性純種新西蘭大白兔42只（南京醫科大學動物實驗中心提供），月齡6.3～8.0個月，平均 （6.9± 0.4）個月；體重為2.8～3.2kg，平均（3.0±0.1）kg。觀察動物的食量、大小便、活動度、步態及精神狀況，無明顯異常后開始實驗。

1.2 實驗標本制備與分組

1.2.1 RA模型制備

用卵蛋白（美國Sigma公司）造模，于右側后肢膝關節內注入5mg溶解的卵蛋白，24h內此關節出現紅、腫、熱、痛等急性炎癥表現。

1.2.2 BMSCs提取和制備

于右脛骨平臺下內側松質骨穿刺，抽取骨髓1.5～2.0ml，使用肝素液抗凝，參照文獻[2]方法分離和培養BMSCs。于倒置顯微鏡下觀察，待細胞融合達80%時傳代培養。取第2代（P2）細胞行流式細胞儀檢測：CD34及CD68表達呈陰性，CD105表達呈陽性。鑒定后，P2細胞經0.25%胰蛋白酶消化計數后，制成1×107/ml細胞懸液。

1.2.3 實驗分組和處理

選取新西蘭大白兔42只，造模第4周取6只兔治療前行MR和病理檢查以對照，余36只隨機分2組，即RA模型組和BMSCs治療組，每組18只，BMSCs治療組于造模后第4周在右后膝關節腔內注射BMSCs懸液0.3ml；RA模型組給予等量的無菌生理鹽水于右膝關節腔內注射。兩組于治療后1、2、3個月分別選取6只兔行MR和病理檢查。

1.3 MR檢查方法及參數

采用Siemens Avanto 1.5T超導磁共振掃描儀行右側后肢膝關節MR檢查，各組經耳緣靜脈注射25mg/kg戊巴比妥鈉全麻后，左側臥位，右膝在上，沙袋固定，應用圓極化柔性小線圈矢狀面掃描；應用三維脂肪抑制快速進動成像序列 （FS-3D-FISP）和三維脂肪抑制擾相梯度回波序列 （FS-3D-FLASH）平掃，并加用FS-3D-FLASH序列增強掃描。FS-3D-FISP的主要參數為TR 38ms，TE 10ms，翻轉角40°，層厚1.5mm，FOV 180mm，掃描矩陣512×384，平均激勵1次，掃描時間440s。FS-3D-FLASH的主要參數為TR 28ms，TE 4176ms，層厚1.5mm，FOV 180mm，掃描矩陣192×192，平均激勵1次，掃描時間489s。增強劑應用Gd-DTPA按0.2mmol/kg，耳緣靜脈注入，20～30min后掃描。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般情況

觀察動物的食量、大小便、活動度、步態及精神狀況。

1.4.2 MRI觀察測量

觀察右后膝關節軟骨厚度改變，測量在Siemens Leonardo VD10B工作站上進行。對右后膝軟骨厚度進行連續測量，取平均值。

1.4.3 標本處理及病理評分

MRI檢查完畢后采用麻醉法處死實驗兔，在膝關節上下1.0～1.5cm處用銳利器械切斷，整塊取下股骨髁部、脛骨平臺及關節囊，觀察大體情況后固定于4%的福爾馬林溶液1天，再脫鈣2周，HE、Masson染色，光鏡下觀察組織形態變化。關節軟骨破壞采用Mankin法[4]對軟骨結構的破壞深度、細胞分布、染色以及潮線的完整性進行綜合評分。

1.5 統計學方法

2 結果

建模后動物精神狀態和進食良好，所有實驗動物均成活到預定觀察時間。

2.1 MRI觀察軟骨厚度的改變

關節軟骨在FS-3D-FISP和FS-3D-FLASH序列上表現為條狀弧形高信號，覆蓋在股骨髁和脛骨平臺的表面，信號均勻，邊緣光整。造模4周治療前顯示關節軟骨變薄，局部有凹陷，部分軟骨信號消失，滑膜積液，但軟骨下骨未受累，FS-3D-FISP和FS-3D-FLASH序列呈高信號 （圖 1），FS-3DFLASH延時增強呈高信號。RA組經1、2、3個月后，軟骨厚度變?。▓D2），但積液減少。BMSCs治療組：治療1、2、3個月后，關節軟骨厚度恢復，輪廓顯示（圖3，4），其中2例軟骨腫脹明顯，1例軟骨厚度恢復不明顯，關節腔積液消失。治療前后兩組兔膝關節軟骨MR測量數據見表1，各組不同的治療時間軟骨厚度差異有統計學意義（P<0.01）；組間比較BMSCs治療組軟骨破壞恢復情況明顯優于RA組 （P< 0.01）；各組兩兩比較除RA組治療前與治療后1月軟骨厚度改變沒有統計學差異外（P>0.05），余均有明顯差異（P<0.01）。

表1 各組兔右膝MRI軟骨厚度（±s，mm）

表1 各組兔右膝MRI軟骨厚度（±s，mm）

注：治療前后各組軟骨厚度，1，2：P<0.01；與RA組比較，1，2：P< 0.01；兩兩比較除RA組治療前與治療后1月，P>0.05，余各組P<0.01。

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2.2 組織學觀察

正常兔膝關節HE染色示軟骨基質基本呈均勻粉紅染色，軟骨表層無裂隙，無缺損，分4層有序排列。表層細胞呈梭形，近似水平排列；中間層細胞圓形，散在分布；深層細胞呈柱狀排列；潮線清晰；鈣化層細胞較大，呈散在分布。造模4周可以看到軟骨表面有蟲蝕樣改變（圖5）。RA組2月及3月時關節面粗糙、侵蝕，關節軟骨組織破壞,軟骨表面糜爛、血管翳形成，可見纖維軟骨細胞修復，細胞排列較亂，無明顯軟骨爬行。BMSCs治療組：治療后1月軟骨表面少量軟骨細胞樣新生細胞；治療2月時，可看到軟骨表面軟骨細胞增生，呈纖維細胞樣排列，伏在缺損軟骨表面，缺損區軟骨充填周邊至中心由厚變?。▓D6）；治療3月時，軟骨表面可見到軟骨細胞增生，與其他殘存軟骨相連，排列基本規則，其厚度趨于一致（圖7）。治療前后兩組兔膝關節軟骨病理評分見表2。各組不同的治療時間軟骨評分差異有統計學意義（P<0.01），組間比較和各組兩兩比較均有明顯差異（P<0.01）。

表2 各組兔軟骨Mankin評分結果（±s）

表2 各組兔軟骨Mankin評分結果（±s）

注：治療前后各組軟骨Mankin評分，1，2：P<0.01；與RA組比較，1，2：P<0.01；兩兩比較，P<0.01。

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2.3 MRI測量與病理學評分的相關性

RA模型組和BMSCs治療組兔膝關節軟骨厚度MRI測量數據與病理學Mankin評分間相關系數r=-0.99和r=-0.998，P<0.05，說明兔膝關節軟骨厚度MRI測量數據與病理學Mankin評分有相關性（負相關）。

3 討論

RA具體的病因和發病機制目前尚未完全明了，由于大量淋巴細胞、單核/巨噬細胞及中性粒細胞浸潤于滑膜間質，從而形成慢性滑膜炎、滑膜增生，隨后血管增生和炎性細胞浸潤逐漸形成血管翳，其覆蓋軟骨后導致其變性和降解。

3.1 MRI序列的選擇及其價值

本實驗采用FS-3D-FLSAH和FS-3D-FISP序列對兔膝關節進行掃描，觀察關節軟骨改變，前者為擾相梯度回波，結合T1加權成像；后者屬于聚相位梯度回波，結合T2加權成像。FS-3D-FISP序列對軟骨顯示研究相對較少，本序列有良好的信噪比，軟骨呈高信號，而關節積液信號更高，有類似關節造影的效應，容易顯示出軟骨缺損輪廓。FS-3D-FISP序列結合水脂分離能獲得高分辨圖像，并減少圖像采集時間，與3D-FS-FLASH相比成像時間縮短了42%以上[4]。張敏等[5]和岳云龍等[6]研究認為FS-3D-FISP序列檢查與關節鏡診斷結果之間具有良好的一致性。實驗中病損的關節軟骨在平掃的 FS-3DFLASH和FS-3D-FISP序列中信號不均，或變薄、缺損，但在增強的FS-3D-FLASH掃描中關節軟骨仍呈條樣高信號，這是由于Gd-DTPA通過滲透方式進入關節軟骨，軟骨變性早期，軟骨基質內蛋白多糖（主要成分為氨基葡聚糖）丟失，作為帶負電荷的Gd-DTPA就可以逐漸滲透至關節軟骨內，取代氨基葡聚糖位置而顯示軟骨的形態[7-10]。但是，研究表明，隨時間的變化，病變軟骨與正常軟骨強化程度不同[11]，因此本實驗應用平掃或增強早期序列測量軟骨較為可靠。兔膝較小，須采用3D掃描技術作連續薄層（層厚1~1.5mm）掃描，提高空間分辨率，減少部分容積效應和信息的丟失，增加對微小病灶的檢出能力。脂肪抑制（FS）能夠應用于各種MR掃描序列中，增加軟骨和骨髓及液體的對比度，減小化學位移偽影，能夠獲得關節軟骨與周圍鄰近組織結構的良好對比。采用脂肪抑制3D-FLASH和3D-FISP序列對膝關節軟骨損傷的顯示和病變分級的準確性明顯優于非脂肪抑制的3D梯度回波序列[12]。標本測量關節軟骨厚度，與MRI所見厚度高度相關[13]。本實驗每只兔都通過MRI測量，其數據與病理學評分有明顯的相關性。

3.2 BMSCs具有組織損傷修復能力

BMSCs體外培養增殖迅速，經適當的誘導可向中胚層的骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞轉化，可作為組織工程研究的細胞來源。國內外多位作者[14-17]報道了利用BMSCs構建骨、軟骨聯合移植物的可行性，用載體或直接將BMSCs植入軟骨缺損處，最后都證實BMSCs能向軟骨表型分化，促進缺損軟骨成功修復。但以上研究所制作的都是軟骨缺損的動物模型而非RA模型，雖然兩者都是軟骨破壞，但前者無法模擬RA所特有的病理和臨床表現。目前BMSCs在體內具有分化產生軟骨細胞的能力已經證實，Hegewald等[18]使用透明質酸和自體滑膜液誘導馬BMSCs分化為軟骨細胞，說明關節天然環境有利于成軟骨分化，這為本實驗關節腔內注射BMSCs形成透明軟骨細胞提供了理論基礎。本實驗中RA模型組關節隨著時間的延長，軟骨厚度在減少，而病理評分在增加，這是由于慢性滑膜炎及新生血管翳對軟骨的侵蝕所致。而BMSCs治療組隨著治療時間的延長，除分別有1例軟骨厚度和病理評分改變沒有統計學差異外，余12例軟骨厚度在明顯恢復，病理評分減低明顯，說明BMSCs在關節腔內可誘導分化為軟骨細胞，對關節軟骨有一定的修復作用。分析3例改變不明顯的原因，可能由于注射的BMSCs懸液流失未聚積在缺損部位所致，如果用可吸收載體效果可能會更好。

綜上所述，BMSCs兔膝RA關節腔內注射可分化為軟骨細胞，修復RA早期階段關節軟骨的退變和破壞。由于條件所限，本研究尚顯粗糙：首先樣本量較小，有待大量的動物實驗證實；其次由于標本較小，因主觀因素，數據測量和評分仍然存在一定的誤差；最后雖然所見的透明樣軟骨修復組織能成功的充填軟骨缺損，但與正常關節軟骨相比，其強度、通透性、膠原纖維的方向性和結構以及蛋白聚糖與膠原網絡的關系等都未能檢測。BMSCs在關節腔內向軟骨細胞分化的分子機制還有待于進一步探討。

[1]崔延安，劉釗，黃海青.兔膝關節類風濕關節炎模型不同序列的MRI表現與病理變化[J].中國醫學影像技術，2009，25（11）：1957-1960.

[2]楊建平，王黎明，徐燕，等.多孔髓芯減壓聯合干細胞移植治療股骨頭壞死的早期隨訪結果 [J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（20）：3936－3939.

[3]Mankin HJ,Dorfman H,Lippiello L,et al.Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hipsⅡ correlation of morphology with biochemical and metabolic data[J].J Bone Joint Surg Am,1971,53（3）:523－537.

[4]Reeder SB,Peic NJ,Alley MT,et al.Rapid imaging of articular cartilage with steady-state free precession and multipoint fat-water separation[J].AJR,2003,180:357-362.

[5]張敏，李石玲，郭智萍，等.膝關節軟骨損傷的MR診斷及與關節鏡結果對照[J].中華放射學雜志，2005，39（7）：731-735.

[6]岳云龍，韓鴻賓.應用改良的FS-3D-True FISP序列診斷膝關節軟骨缺損性病變[J].中國醫學影像技術，2007，23（1）：105-108.

[7]Samosky JT,Burstein D,Grimson EW.Spatially localized correlation of GEMRIC-mechanical stiffness in the human tibial plateau [J].Orthop Res,2005,23:93-101.

[8]Squires GR,Okounef S,Ionescu M.The pathobiology of focal lesion development in aging human articular cartilage and molecular matrix changescharacteristic ofosteoarthritis[J].Arthritis Rheum,2003,48:1261-1270.

[9]Vander Harst MR,Brama PA,Vande Lest CH,et al.An integral biochemical analysis of the main constituents of articular cartilage subchondral and trabecular bone[J].Osteoarthritis Cartilage,2004, 12:752-761.

[10]Vande Lest CH,Brama PA,Van El B.Extracellular matrix changes in early osteochondrotic defects in foals:a key role for collagen？[J].Biochem Biophys Acta,2004,1690:54-62.

[11]Tiderius CJ,Olsson LE,de Verdier H.Gd-DTPA enhanced MRI of femoral knee cartilage:a dose-response study in healthy volunteers[J].Magn Reson Med,2001,46:1067-1071.

[12]Uhl M,Allmann KH,Tauer U,et al.Comparison of MR sequences in quantifying in vitro cartilage degeneration in osteoarthritis of the knee[J].Br J Radiol,1998,71:291-296.

[13]Gylys-Morin VM,Hajek PC,Sartoris DJ,et al.Articular cartilage defects:detectability in cadaver with MR[J].Am J Roentgenilogy,1987,148(6):1153.

[14]Gao J,Dennis JE,Solchaga LA,et al.Tissue engineered fabrication of an osteochondral composite graft using rat bone marrow derived mesenchymal stem cells[J].Tissue Eng,2001,7(4): 363-371.

[15]Zhou GD,Wang XY,Miao CL,et al.Repairing porcine knee joint osteochondral defects at non-weight bearing area by autologous BMSC[J].Chin Med J,2004,84(11):925-931.

[16]Ponticiello MS,Schinagl RM,Kadiyala S,et al.Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy[J].J Biomed Mater Res,2000,52(2):246－255.

[17]Xiang Z,Hu W,Kong Q,et al.Preliminary study of mesenchymal stem cells-seeded type I collagen-glycosaminoglycan matrices for cartilage repair[J].Chin J Reparat and Reconst,2006, 20(2):148－154.

[18]Hegewald AA,Ringe J,Bartel J,et al.Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells:a preliminary study[J].Tissue Cell,2004,36(6):431－438.