HPLC-ELSD法測定抗感顆粒中綠原酸含量

張亞明

(江蘇省鹽城市第一人民醫院,江蘇鹽城,224001)

抗感顆粒為金銀花、赤芍、綿馬貫眾經加工制成的顆粒。具有清熱解毒的功能,主治外感風熱引起的感冒。綠原酸被認為是抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分,通常被作為定性定量的指標。《中國藥典》2010年版采用薄層層析法對綠原酸進行定性鑒別,未收載測定含量的方法[1]。文獻有采用薄層掃描法[2],RP-HPLC[3-4],HPLC法[5-8],二階導數紫外光譜法[9]和分光光度法[10]測定綠原酸含量的報道。為有效控制抗感顆粒的質量,探索綠原酸含量測定新方法,本文對用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法(HPLCELSD)測定抗感顆粒中綠原酸含量的方法進行了研究。

1 儀器與試藥

LC-10AT vp型高效液相色譜儀(日本島津公司),Varian 380-LC型蒸發光散射檢測器(美國瓦里安公司),SPD-10A vp型紫外檢測器(日本島津公司)HW-2000色譜工作站,AS230自動進樣器,AT330柱溫箱,CA-3型靜音無油空氣泵,BP211D電子天平,6171型pH/mv測試器,CQ-250型超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司)。

綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110753-200413,供含量測定用),抗感顆粒(貴州盛世龍方制藥股份有限公司,批號:20090612,20090628,20090705);乙腈為一級色譜純,水為重蒸餾水;其他化學試劑均為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Lichrospher C18,4.6 mm×150 mm,5 μ m;流動相:0.5%冰醋酸水溶液-乙腈(75:25);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:20 μ L。ELSD 條件:漂移管溫度為90 ℃,載氣1.6 Bar。理論板數按綠原酸峰計算不低于2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備:精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h以上的綠原酸對照品50.18 mg,置50 mL量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.2 供試品溶液的制備:取本品,研細,取約1 g,精密稱定,置具塞棕色瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率 40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取濾液,用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過,取續濾液,置棕色瓶中,即得。

2.3 標準曲線的制備

分別精密量取2.2.1中的對照品溶液2 mL、3 mL、4 mL 、5 mL 置10 mL的量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻。取以上4種濃度溶液及2.2.1中的對照品溶液各20 μ L注入液相色譜儀,測定。以峰面積的對數值與濃度的對數值進行線性回歸,得回歸方程LogC=0.63512LogA-4.4523,r=0.9997,表明濃度在0.2～1 mg/mL內線性關系良好。

2.4 穩定性實驗

取同一樣品溶液,每隔2 h進樣1次,測定5次,相對標準偏差(RSD)為0.63%。

2.5 回收率試驗

分別精密量取2.2.1中的對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL置10 mL的量瓶中,加供試品溶液稀釋至刻度,搖勻。取以上3種濃度溶液各20 μ L注入液相色譜儀,測定。每種濃度連續進樣3次,取其平均值計算。結果平均回收率為99.5%。

2.6 精密度試驗

精密量取2.2.1中的對照品溶液5 mL置10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,重復進樣6次,RSD為0.35%。

2.7 樣品含量測定

取 2.2.2 供試品溶液 ,濾過 ,進樣 20 μ L,按2.1條件測定,用2.3回歸方程計算供試品的含量,測定3批樣品,平行測定4次,3批樣品的含量平均值分別為99.8%、99.6%、99.8%,RSD分別為0.39%、0.48%、0.44%。

3 討 論

抗感顆粒可清熱解毒,用于外感風熱引起的發熱、頭痛、鼻塞、噴嚏、咽痛、全身乏力、酸痛等癥[11-12]。抗感顆粒中的主要成分金銀花藥用歷史悠久,為常用的清熱解毒藥,它的作用廣泛,具有清熱解毒、散風消腫的功能,主治風熱感冒、肺炎、咽喉腫痛、急性細菌性痢疾、嬰幼兒腹瀉等證。金銀花屬于忍冬科,主要含有綠原酸、異綠原酸、揮發油、咖啡酸、黃酮、皂苷等。按2005版中國藥典規定,金銀花中的標志性成分是綠原酸和木犀草苷,綠原酸常作為金銀花質量控制的指標成分[13-14]。因為綠原酸和木犀草苷的最大吸收波長不致,所以需要分別用HPLC法測定綠原酸和木犀草苷的含量,增加了檢測工作量。

ELSD是一種通用質量型檢測器,可以克服紫外檢測器的以上缺點,對測定條件下所有通過漂移管仍未蒸發的氣化的固體顆粒都會響應,因而對持續通過漂移管的流動相要求應全部揮發。因此本文采用ELSD檢測器對其進行同時測定,研究結果顯示,應用ELSD檢測器,可充分排除流動相紫外吸收對含量測定的影響,此法準確,精密度、重現性好、回收率高,為金銀花藥材的質量控制提供了快速、準確的測定方法。研究發現載氣流速和漂移管的溫度對ELSD的檢測性能有較大影響,在儀器規定的參數范圍內經反復實驗,最終確定ELSD檢測器的參數為漂移管溫度為90℃,載氣1.6 Bar。在實驗中,我們選擇了醋酸-水-乙腈體系,將綠原酸有效洗脫出來,且可全部揮發以減少其對測定的影響。蒸發光檢測器靈敏度較高,檢出限可達10 ng。在本實驗條件下,綠原酸的檢測限為30 ng(S/N=2),完全能夠滿足檢測要求。此色譜條件可同時用于含綠原酸的其它中成藥的含量測定。亦可用于這類藥物的鑒別。

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