蛋白質快速檢測儀測定乳及乳制品中蛋白質

摘 要 采用研制的蛋白質快速檢測儀， 系統地考察了溫度、時間和干擾物質等因素對蛋白質測定的影響及檢測儀的重復性， 并將檢測儀應用于新鮮乳、純牛奶、牛奶飲料（核桃、燕麥、紅棗）、牛初乳、奶粉、豆奶粉、豆漿粉和雞蛋等樣品中蛋白質的定量測定。實驗結果表明， 在17～40 ℃條件下， 蛋白質試劑與蛋白質在1 min內即可完成反應， 整個蛋白質含量測定過程僅需5～10 min， 測定結果的精密度（RSD）小于1%， 與凱式定氮法測定結果和標準物質比較， 測定結果的相對誤差均小于5%， 且不受三聚氰胺、尿素、甘氨酸和硝酸銨等非蛋白氮的干擾， 表明此儀器具有較好的準確度和重復性， 可應用于乳及乳制品中蛋白質的快速定量測定。

關鍵詞 蛋白質快速檢測儀； 乳及乳制品； 快速測定

1 引 言

蛋白質是生命現象中最基本的物質基礎， 具有調節生理功能， 充當藥物分子、維生素、礦物質與微量元素的載體等功能。食用乳及乳制品是人體攝入蛋白質的重要途徑之一。為了保證乳及乳制品的質量， 我國在《生乳安全標準》、《GB/T 5410-2008乳粉》和《NY 5045-2001無公害食品 生鮮牛乳》等標準中都明確規定了乳及乳制品中蛋白質含量要求。但一些不法分子為了獲取經濟利益， 向乳制品中添加含氮量高的無機物質（如三聚氰胺、尿素、硝酸銨等）以提高蛋白質的含量， 嚴重影響乳制品的質量和人們的身體健康。有關乳及乳制品中蛋白質含量不達標所引起的食品中毒事件時有發生， 乳制品安全引起了社會極大關注。我國和國際上均出臺了一系列標準的乳及乳制品中蛋白質含量的測定方法， 如凱氏定氮法［1，2］、杜馬斯燃燒法［3～5］等。凱氏定氮法是我國用于蛋白質測定的常規檢測方法， 它是通過樣品消解將樣品中所有氮元素轉化為氨， 通過H2SO4或HCl標準溶液進行滴定， 實現樣品中蛋白質的測定， 完成一個樣品的整個分析過程至少需要2 h。從其原理可知， 樣品消解后所有氮元素均轉化為氨， 故該法無法區分蛋白質氮與非蛋白質氮。2001年， 國際標準化組織和國際乳品聯合會發布了乳制品中非蛋白氮的測定標準方法［6］， 該法提出了蛋白氮和非蛋白氮分離方法， 彌補了凱氏定氮法不能區分蛋白氮和非蛋白氮的缺陷， 該方法我國于2008年等同引用［7］。杜馬斯燃燒法是國際上常用于蛋白質含量測定的方法。樣品燃燒后生成的氮氧化物在鎢上還原為分子氮， 分子氮由二氧化碳載氣運送到TCD熱導檢測器， 氮含量引發一種電子測量信號， 經過標準物質獨立校正被測樣品中氮含量， 然后轉換為蛋白質的含量。從原理上看， 如不對樣品進行預處理， 該方法與凱氏定氮法同樣也無法區分蛋白質氮和非蛋白質氮。本研究開發出一種能夠對乳及乳制品中蛋白質快速、準確、定量且不受非蛋白質氮干擾的蛋白質快速檢測儀［8］。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

GDYN-200S蛋白質快速檢測儀（長春吉大#8226;小天鵝儀器有限公司）；Setra BL-120S分析天平（美國西特Setra公司）；奶粉中蛋白質標物（BW3832-1/ BW3832-2/ BW3832-3）購于國家標準物質研究中心；蛋白質試劑（主成分為偶氮染料， 長春吉大#8226;小天鵝儀器有限公司）：將蛋白質試劑全部轉移至2 L蛋白質試劑分取器，用水稀釋至2 L， 備用。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品前處理 （1）牛奶 準確稱取1.000 g牛奶于塑料樣品杯中， 注入40 mL蛋白質試劑， 攪拌1 min， 以12000 r/min離心3 min， 上清液為待測溶液。（2）奶粉 準確稱取10.000 g奶粉于塑料樣品杯中， 加入90 mL蒸餾水， 攪拌3 min， 此溶液為奶粉稀釋液。其它步驟同牛奶蛋白質測定步驟。（3）雞蛋 取2.000 g攪拌均勻的生雞蛋液， 加入1.0 mL雞蛋蛋白質前處理試劑和7 mL蒸餾水， 搖勻， 準確稱取0.500 g上述處理后雞蛋樣品于塑料樣品杯中， 注入40 mL蛋白質試劑， 攪拌1 min， 分取攪拌后溶液， 以12000 r/min離心3 min， 上清液為待測溶液。

2.2.2 測量 以蒸餾水為空白， 通過GDYN-200S蛋白質快速檢測儀檢測蛋白質試劑反應前后吸光度， 根據儀器內置數據處理系統計算樣品中蛋白質的含量。

3 蛋白質快速檢測儀原理和結構

3.1 儀器的分析原理

將某些有機試劑適量加入到含有蛋白質的溶液中時， 有機試劑與蛋白質相互作用生成不溶性化合物（這些有機試劑可稱為蛋白質試劑）， 離心分離不溶性化合物， 未與蛋白質反應的有機試劑仍存在溶液中。通過定量加入的有機試劑， 借助蛋白質快速檢測儀檢測有機試劑吸光度的變化， 可測定出樣品中蛋白質的含量。因為溶液吸光度與有機試劑的濃度成正比， 當蛋白質存在時， 溶液中有機試劑濃度降低， 其溶液吸光度也降低， 降低程度與蛋白質濃度相關［9］。

3.2 蛋白質快速檢測儀結構

蛋白質快速檢測儀主要由樣品稱量、顯色分離和測量3部分構成， 其中稱量部分由分析天平完成， 通過數據線直接將數據傳輸到GDYN-200S蛋白質快速檢測儀。蛋白質檢測儀結構如圖1所示， 主要由光源， 比色池、檢測器、硬件驅動系統和顯示系統等構成。

采用中心波長為483 nm的超高亮發光二極管（LED）［10］作光源， 該光源又作為單色器， 使用壽命為106 h。與傳統便攜式分光光度計相比， 儀器無需光柵和棱鏡等分光器件， 簡化了儀器光路系統， 降低成本， 增加了儀器的抗震和抗干擾能力。蛋白質試劑在483 nm處具有較大摩爾吸光系數， 如采用傳統的光程為1 cm比色池， 需稀釋后才能測量。為了減少樣品稀釋引起的測量誤差， 該儀器的比色池采用光程僅為2 mm流通式結構， 借助注射器實現被測樣品的引入。檢測器為TSL系列集成光頻轉換器， 可直接將光信號轉化為頻率信號實現光頻數字化檢測。微控制器采用32位ARM AT91SAM7S256作為儀器的邏輯控制核心， 可直接對TSL系列光頻轉換器的輸出頻率進行計數， 從而得到透射光的強度值。程序采用ARM匯編與C語言編寫， 開發工具為GNU arm-elf-toolchain， 嵌入式控制軟件整體流程如圖2所示。

4 結果與討論

4.1 蛋白質試劑光譜圖

采用紫外可見分光光度計對蛋白質試劑及其與蛋白質反應離心后的上清液進行光譜掃描（圖3）。從圖3可見， 蛋白質試劑在483 nm處具有較強的特征吸收（曲線1）。當樣品中蛋白質與試劑發生特異性反應， 用紫外可見分光光度計掃描上清液， 發現上清液（即未反應的蛋白質試劑）在483 nm處仍有一個較強的特征吸收峰（曲線2）， 其吸收峰形狀和位置未發生改變， 但吸光度強度明顯降低， 且隨著蛋白質含量的增加其降低程度增大。同時發現， 蛋白質試劑反應前后吸光度變化值與待測物質中蛋白質的含量具有一定關系， 即， 其中， 為蛋白質試劑反應前后吸光度變化值；為蛋白質濃度；為吸收系數， 即表示蛋白質濃度變化1個單位引起的吸光度值的變化。據此， 本研究建立了蛋白質的快速測定方法。檢測儀選用483 nm的超高亮發光二極管作為光源。

4.2 溫度對測定結果的影響

考察了不同溫度對蛋白質含量測定的影響。如表1所示， 在溫度17～40 ℃范圍內， 溫度對GDYN-200S蛋白質快速檢測儀測定樣品中蛋白質（標準值3.07%）無影響。

4.3 時間對測定結果的影響

考察了蛋白質試劑與蛋白質反應時間對測定結果的影響， 結果表明， 在室溫條件下， 攪拌1 min樣品中的蛋白質可與蛋白質試劑發生特異性反應；同時考察蛋白質試劑反應后上清液的穩定性， 由表2可見， 在2 h內測定的A和B兩牛奶樣品的蛋白質含量保持不變。整個蛋白質測定過程僅需5～10 min， 與凱氏定氮法2～3 h相比， 檢測時間顯著縮短。

4.4 測定結果的重復性

考察了GDYN-200S蛋白質快速檢測儀對樣品測定結果的重復性。對A、B兩牛奶樣品蛋白質含量重復測定11次， 其測定結果的精密度分別為0.9%和0.5%， 表明GDYN-200S蛋白質快速檢測儀測定結果具有良好的精密度。

4.5 干擾試驗從蛋白質檢測儀原理可知， 檢測信號為蛋白質試劑反應前后吸光度變化值。向蛋白質試劑中添加一定量的三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸銨等非蛋白氮物質， 以驗證非蛋白氮是否干擾蛋白質的測定， 結果如表3所示。通過紫外-可見分光光度計掃描可知， 三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸銨等添加物在483 nm處均無吸收， 當加入蛋白質試劑時， 未見不溶性化合物生成， 蛋白質試劑溶液吸光度也未發生變化， 表明三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸銨等未與蛋白質試劑反應， 不影響蛋白質的測定。

向鮮奶樣品中添加三聚氰胺， 結果如表4所示， 當三聚氰胺添加量≤0.1 g/20 mL時， 添加與不添加三聚氰胺對測定結果無影響；但添加量過高時， 蛋白質測定結果偏低， 這是因為隨著三聚氰胺添加量的逐漸增加， 蛋白質在添加了三聚氰胺的樣品中的質量分數逐漸降低所致。

4.6 蛋白質快速檢測儀的應用

將研制的GDYN-200S蛋白質快速檢測儀應用到新鮮乳、市售純牛奶、牛奶飲料（核桃、燕麥、紅棗）、奶粉（包括牛初乳粉）、豆漿粉、豆奶粉和雞蛋等500個樣品中蛋白質的定量測定， 并與凱氏定氮法進行比較， 同時測定了3種奶粉中蛋白質標準物質， 部分結果見表5所示。從檢測數據可知， 與凱氏定氮法測定結果（依據國家標準方法［1，7］分別測定樣品中的總氮和非蛋白氮， 二者差減后計算出樣品中真實的蛋白質含量）與標準物質相比， 其相對誤差均小于5%。

從實驗結果可知， 蛋白質試劑可快速定量與樣品中蛋白質發生反應（1 min）， 且能穩定2 h， 單一樣品全程檢測周期僅需5～10 min；因蛋白質試劑僅與蛋白質氮特異性反應， 避免了三聚氰胺、尿素、甘氨酸和硝酸銨等非蛋白氮的干擾；同時該儀器和方法操作簡單， 避免了傳統檢測方法消解、蒸餾和滴定等復雜步驟， 適用于實際樣品中的蛋白質定量檢測。

References

1 GB/T 5009.5-2010， Determination of Protein in Foods（食品中蛋白質的測定）. National Standards of the People′s Republic of China（中華人民共和國國家標準）

2 GB/T 5410-2008， Milk Power（乳粉）. National Standards of the People's Republic of China（中華人民共和國國家標準）

3 ISO 14891/IDF 185: 2002 Milk and Milk Products-Determination of Nitrogen Content-Routine Method Using Combustion According to the Dumas Principle

4 Marco A， Rubio R， Compano R， Casals I. Talanta， 2002， 57: 1019～1026

5 Saint-Denis T， Goupy J. Analytica Chimica Acta， 2004， 515: 191～198

6 ISO 8968-4/IDF 20-4: 2001 Milk-Determination of Nitrogen Content Part 4: Determination of Non-protein-nitrogen Content

7 GB/T 21704-2008， Determination of Non-protein-nitrogen Content in Milk and Dairy Products（乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定）. National Standards of the People′s Republic of China（中華人民共和國國家標準）

8 YU Ai-Min， WANG Zhen-De（于愛民， 王振德） . China Patent（中國專利）， ZL200820209752.9

9 WANG Jing-Yan， ZHU Sheng-Geng， XU Chang-Fa（王鏡巖， 朱圣庚， 徐長法）. Biochemistry（生物化學）． Beijing（北京）: Higher Education Press（高等教育出版社）， 2002: 300

10 YU Ai-Min， WANG Zhen-De（于愛民， 王振德）. China Patent（中國專利）， ZL200720003016.3

Fast Determination of Protein in Milk and Dairy

Products Using Protein Fast Analyzer

FENG Xu-Dong1， AN Wei-Dong2， DING Yi1， YU Ai-Min1， LIU Jing3，

GAO De-Jiang3， WANG Zhi-Hong4， YU Yong4

1（College of Chemistry， Jilin University， Changchun 130012）

2（Jilin Institute of Metrology， Changchun 130022）

3（Changchun Jilin University-Little Swan Instruments Co.， Ltd.， Changchun 130012）

4（College of Instrumentation Electrical Engineering， Jilin University， Changchun 130012）

Abstract A rapid analyzer for the determination of protein were developed. The effects of experimental parameters， including temperature， time， and foreign substances were investigated. Several milk and dairy products were analyzed using the protein fast analyzer. The experimental results showed that protein reagent can react with protein within 1 min at room temperature. The whole process of protein determination in dairy products only takes 5－10 min. The protein fast analyzer was applied to the determination of protein in dairy products， the relative error is lower 5% compared to Kjeldahl method and standard amount method of protein in milk power. The relative standard deviation is lower 1%. The determination results of protein were not affected by foreign substances， such as melamine， urea， glycine， ammonium nitrate and so on.

Keywords Protein fast analyzer; Milk and dairy products; Fast determination