小型波長檢測型表面等離子體共振分析儀的設計與研制

摘 要 小型波長檢測型表面等離子體共振（SPR）分析儀采用固定光的入射角， 監測共振波長變化的測量模式， 可進行多波長同時測量。設計并組裝了SPR分析儀中的微型光纖光譜儀， 采用光導纖維輸入被測光， 固定全息衍射光柵分光， 線陣CCD光電傳感器檢測， 可檢測的波長范圍是500～900 nm， 分辨率0.23 nm。自行編制了控制傳感器數據采集和處理的計算機軟件， 采用信號強度對波長（實際譜圖中的橫縱坐標）收集實驗數據。SPR分析儀不僅小型化， 且具有良好的分析性能， 可用于定量分析生物分子間相互作用的研究， 對人免疫球蛋白（IgG）進行了實時檢測， 采用3種不同的方法所得到人IgG的最低濃度達到0.15 mg/L， 并對儀器的穩定性、樣品的生物活性等因素進行了考察。

關鍵詞 表面等離子體共振； 微型光纖光譜儀； 波長檢測型

1 引 言

表面等離子體共振（SPR）是入射光在兩相界面處發生全內反射時的消失波， 可以引發金屬表面的自由電子產生表面等離子體子［1，2］。在入射角或波長為某一適當值的條件下， 表面等離子體子與消失波的頻率和波數相等， 二者將發生共振， 入射光被吸收， 使反射光強度急劇下降， 在反射光譜上反射光強度最低點所對應的波長為共振波長。當金屬薄膜表面介質折射率不同時， 共振波長也不同［3］。

目前， 應用的SPR商品儀器基本是角度調制型， 測量的角度范圍有限， 儀器本身也比較昂貴［4，5］。本研究基于光柵有的高光譜分辨率和光纖的高光傳輸能力， 且采用光纖可使儀器的設計更加方便， 構型更加緊湊， 宜于儀器的小型化， 成功研制了多波長同時檢測型SPR分析儀。本儀器體積小， 重量輕， 波長范圍很寬， 可用于定量分析， 特別適于分子間相互作用［6～9］、生物分子與藥物分子相互作用［10，11］的研究。設計并組裝了與SPR分析儀相匹配的檢測器——微型光纖光譜儀， 采用光導纖維輸入被測光， 固定全息衍射光柵分光， 線陣CCD光電傳感器檢測。本儀器既可以應用于SPR儀器作為檢測單元， 也可以應用于其它光譜分析領域。

2 SPR分析儀的設計與研制

2.1 儀器結構

多波長同時檢測型SPR分析儀如圖1a所示， 儀器由光源、導光系統、SPR傳感元件、流通池、微型光纖光譜儀和數據處理系統組成。選用鹵鎢燈作為光源， 從光源發出的白色光經過由2個透鏡和1個偏振片構成的平行偏振光管后變成平行偏振光， 通過平行偏振光管的出射端狹縫， 以一定的角度照射到棱鏡的側面上， 經折射后光線到達棱鏡的底部（預先用Snell定律計算出保證光線在此界面發生全內反射的入射角度）， 底部的外側鍍一層50 nm厚的金屬薄膜， 流通池密封在其上面。光線在棱鏡與金屬的界面處發生全內反射， 然后從棱鏡的另一個側面折射出去， 通過下一個透鏡聚焦耦合進入微型光纖光譜儀進行分光檢測。波長檢測型SPR分析儀可以實現多波長同時檢測， 且檢測的波長范圍不受限制， 這樣不僅使傳感器表面被檢測物質量的范圍不受限制， 即折射率變化的范圍不受限制， 而且非常有益于生物分子與藥物分子、分子與組織（如細胞）間相互的作用的研究。

自行設計并組裝的波長檢測型SPR分析儀如圖1b所示， 儀器的外型尺寸為42 cm×32 cm×13 cm。

2.2 光源

采用固定波長、改變入射角為測量方式的SPR儀器和裝置多采用He-Ne激光器（λ＝632.8 nm）做光源。發光二極管（LED）也被用作SPR的光源， 波長多選擇為760 nm。

對于波長檢測型SPR傳感裝置， 最理想的光源應是可以發射各種波長光的連續光源， 而且強度不隨波長而改變， 并具有足夠的強度和穩定性， 但實際上很難找到這種光源。在各種連續光源中， 白熾燈光源是最廉價易得的， 并且具有足夠穩定的發光強度， 其中， 鹵鎢燈就很適于做SPR研究的光源。鹵鎢燈在可見光區有連續發射光譜， 并且由于鎢的揮發與沉積的循環過程， 使燈絲不易蒸發損失， 燈的使用壽命較長；其缺點是電流直接流經燈絲， 發光強度受電壓的波動影響較大。經過比較， 選擇碘鎢燈作為光源。

2.3 導光系統和傳感元件

導光系統由透鏡、偏振片和光纖組成。實驗中使用的連續光源可近似看作點光源， 向各個角度發射光， 為了保證入射到棱鏡的所有光束的入射角相同， 且可固定在某一特定值， 必須將光源發出的光準直為平行光束， 然后再照射到傳感元件棱鏡的一個側面上。因此選擇2個小透鏡， 見圖1a。2個透鏡的距離經過計算， 使其焦點重合。

波長檢測型SPR分析儀需要使用偏振光， 因此入射光必須經過偏振器起偏， 將一個小的圓形偏振片置于上述的2個小透鏡之后， 與2個小透鏡共同組成平行光管。在平行偏振光管的出射端加1個狹縫， 調整并固定光源的角度， 使透過狹縫的平行偏振光以一定的角度照射在傳感元件棱鏡的一個側面上。

由棱鏡另一側面出射的光經過透鏡聚焦后， 引入光纖， 光纖一端置于透鏡的焦點處， 使聚焦的光全部進入光纖， 再進入微型光纖光譜儀進行檢測。

在組裝的SPR分析儀中， 選用玻璃棱鏡作為傳感元件。對于棱鏡的光學材料， 應用最普遍的是光學玻璃。由理論計算可知， 對于SPR研究， 棱鏡與介質的折射率差別越大， 測定的靈敏度越高。因此， 為了提高靈敏度應選擇折射率較高的光學材料制作棱鏡。但是， 高折射率的光學材料， 其表面的機械強

度和穩定性都較差， 在空氣中易形成氧化膜。加工了3種不同牌號（中國）的棱鏡， 其相近折射率光學材料的牌號和折射率值對照見表1。

從耐用的角度考慮， 選用K9光學玻璃做為棱鏡材料。棱鏡的形狀為半球形時最理想， 它可以保證與半球形底面成0～180°角的入射光線均與界面垂直， 反射光的損失小， 且進入棱鏡后光線的角度不變， 但半球形的棱鏡加工費用較高。本研究選擇容易制作的直角等腰三角形棱鏡， 其邊長尺寸為2.7 cm×1.7 cm×1.7 cm。

許多金屬都可以作為SPR傳感元件的金屬膜， 而金和銀是兩種應用較普遍的金屬， 并且銀膜的靈敏度高于金膜。表2列出了金和銀作為SPR傳感部位金屬膜的性能比較。兩種金屬膜在使用過程中各有特點。金膜的優點是穩定性好， 不易氧化；與玻璃的粘接性好， 不易脫落；不與反應體系中的各種無機離子發生反應， 從而不影響生物體系的測定結果。金膜的缺點是價格略高， 靈敏度稍差。銀膜的優點是靈敏度高， 價格低；缺點是與玻璃的粘著性不好，易脫落；溶解生物樣品的緩沖溶液基本為磷酸鹽緩沖液（PBS）， 其中含有無機離子Cl－， 而過多的Cl－會損害銀膜。因此， 對于大多數生物體系的SPR研究， 不宜選擇銀膜作為基底傳感膜。

表3列出了利用K9玻璃時入射波長及其所對應的折射率。從表3可見， 對于500～600 nm的可見光， 折射率會隨著波長的增加而減小， 而通常應用傳感器的波長范圍多在此波段。由于不同波長的入射光在棱鏡內的折射率不同， 入射光通過棱鏡后， 出射光的位置也不同。分別以500和600 nm的入射波長為例， 計算其出射光進入光纖前光線的距離。根據表3列出的入射光在500和600 nm時的折射率n500＝1.5214和n600＝1.5163， 可以根據Snell定律：n0sinα0＝n1 sinα1， 計算折射角和全反射角； 再根據棱鏡的實際長度， 計算得到這兩條不同波長的光進入棱鏡， 經棱鏡折射出時光線的距離為3.675×10－5 m， 該距離不會對反射光的收集產生影響。

2.4 流通池

SPR的研究對象多為生物分子的相互作用， 因此， 流通池的設計原則應是盡可能使體積最小。流通池的幾何形狀為圓柱體， 直徑為12.0 mm， 深度為1.5 mm。實驗時， 若樣品量較充足（例如測定非生物樣品）， 最好采用蠕動泵進樣， 效果較好。若樣品量很少， 為了避免在管路中的浪費， 也可以用注射器直接進樣。

2.5 微型光纖光譜儀

微型光纖光譜儀主要包括分光系統和電學系統以及它與數據處理系統、SPR傳感元件的接口， 其結構如圖2所示。該光譜儀的波長檢測范圍為500～900 nm， 分辨率為0.23 nm。

光柵是微型光纖光譜儀的“心臟”， 其性能的優劣決定儀器整體的光學性能。在綜合考慮各種光柵的價格和性能后， 采用平面全息衍射光柵， 刻線密度為600和1200條/mm；由于波長檢測型SPR分析儀需要測量的光譜主要集中在可見波長區， 綜合考慮各種檢測器的價格和性能， 采用日本Toshiba（東芝）公司生產的TCD1304AP型（3648像素）線陣CCD檢測器和日本Sony（索尼）公司生產的ILX554B型（2048像素）線陣CCD檢測器。這兩種檢測器都是高靈敏檢測器， 分別具有13和18個暗（光譜遮蔽）像素， 可減小外界溫度變化對線陣CCD檢測器光強測量結果造成的干擾， 其動態范圍（像素飽和輸出電壓與暗電壓之比）分別為300和333；采用美國Analog Devices（模擬器件）公司生產的AD9220型A/D轉換器作為電子器件， 其最大轉換速率為每秒10 M次， 轉換精度為12位并具有溢出指示功能， 最大功耗低于250 mW；采用美國Atmel（愛特梅爾）公司生產的AT91SAM7S64型微處理器， 該處理器采用ARM7TDMI處理器核心， 高性能32位精簡指令集架構， 具有低性能/功耗比和嵌入式電路仿真功能， 運行頻率可達55 MHz， 并且具有USB2.0全速接口和大量其它接口。

微型光纖光譜儀采用緊湊的Czerny-Turner光路設計以減小光學平臺尺寸。入射光由一個標準的SMA905光纖接口進入光學平臺， 經球面反射鏡1準直， 然后由平面光柵分光， 經由球面反射鏡2聚焦到線陣CCD檢測器上。

微型光纖光譜儀的電學設計目標是低功耗、穩定可靠和抗干擾能力強。在電學設計時采用了以下方式：（1）電路中的強、弱電和交、直流電分開走線， 以避免彼此間的干擾；（2）各芯片的電源電路中均加入濾波電容進行濾波；（3）采用質量優良的元器件。

微型光纖光譜儀的外殼和內部光學底座擬采用鑄鋁材料鑄造成型， 光學部件與電學器件分腔放置。在光學腔中， 分光器件和線陣CCD檢測器被牢固地固定在光學底座上， 腔內無任何其它電子元件；所有的電路和電學器件被隔離在電學腔中。這樣， 既提高了光學系統的穩定性和電學系統的抗干擾能力， 又使光學部件和電學器件的調試過程互不干擾。

微型光纖光譜儀采用的是嵌入式系統固件設計， 嵌入式系統固件的主要功能有：（1）通過處理器的多個I/O端口控制儀器的各種邏輯狀態；（2）通過處理器的地址線和數據線讀取A/D轉換器轉換出的數字信號， 并進行一定的預處理（如判斷是否溢出等）；（3）通過微處理器的USB接口接受PC機發出的命令， 并向PC機傳送光譜數據；（4）通過儀器跳線的設置判斷并啟動自升級功能。

2.6 數據處理系統

自行編制了控制傳感器數據采集和處理的計算機軟件， 采用信號強度對波長（實際譜圖中的橫縱坐標）收集實驗數據。計算機程序從數據采集卡端口讀取信號強度， 一定時間間隔內讀取多次， 以平均值作為強度值， 由多個數據點組成一副譜圖。利用控制軟件在譜圖上選擇一個可用的數據范圍， 在數據范圍內對橫縱坐標的數值進行六次多項式擬合， 以擬合結果和實際數據點的相對標準偏差最小為擬合終點， 從而可以得到一個六次曲線函數。接著， 計算機程序對該函數進行求導數處理， 得到一個五次函數， 這時令函數中Y＝0， 就可以得到一個五次方程， 求得的X值就是得到六次擬合函數取極值（一定區間范圍內的最大值、最小值）時對應的橫坐標。采用二分法可以對該五次方程進行求解， 以兩次二分值的差值和二者平均值的比值小于10－7為求解終點。將這個值代入擬合得到的六次函數， 可求得縱坐標值。如果該函數有多個極值， 可采用多段區間分別求解的方法逐個得到極值的坐標。這樣就可以得到實驗所需的最低點及其對應的強度值。

3 結果與討論

3.1 人IgG的檢測

分別采用金膜以及Au納米粒子和Au/Ag合金納米粒子修飾的金膜作為傳感器的基底膜， 檢測人IgG與其抗體的結合。在室溫下， 首先通過共價結合將兔抗人IgG固定在生物傳感器的表面， 再將PBS緩沖溶液稀釋的不同濃度的人IgG分別加入到流通池中， 使抗原能夠與固定在生物傳感器表面的抗體結合。抗原與固定在表面的抗體結合的量可由共振波長的變化測得。

在室溫下， 兔抗人IgG連接在生物傳感器表面以后， 不同濃度的人IgG分別注入到流通池中， 實時記錄由于抗體-抗原免疫反應所引起共振波長的變化。圖3顯示了共振波長變化與人IgG濃度之間的關系。基于Au膜的傳感器檢測到人IgG的濃度范圍是1.25～20.0 mg/L；基于Au納米粒子修飾的傳感器所檢測到人IgG的濃度范圍是0.30～20.0 mg/L；基于Au/Ag合金納米粒子的傳感器所檢測到人IgG的濃度范圍是0.15～40.0 mg/L。以上實驗結果表明納米粒子在修飾SPR傳感器中具有的顯著優勢。 3.2 儀器的穩定性

為了測試傳感膜的穩定性， 多次對于同一濃度的IgG與其抗體的免疫結合進行檢測。若傳感器金膜表面未固定抗體時， 共振波長為λ， 固定抗體后， 共振波長為λ1， λ1－λ即為固定抗體的最大位移值Δλ。以此固定抗體的傳感器用于檢測抗原， 檢測一定次數后， 將抗原洗脫， 此時共振波長為λi， 位移值為Δλi＝λi－λ， （Δλ－Δλi）/Δλ×100%即為傳感膜穩定性變化的百分率。實驗結果表明， 在對人IgG進行檢測的24 h內， 固定在傳感膜上的抗體有少量的流失， 穩定性約降低2%。檢測持續4 d后， 傳感膜的穩定性約降低4%。隨著時間的推移， 傳感膜活性降低， 主要是由于在檢測過程中緩沖溶液將少部分的抗體沖掉而造成的。同時， 生物試劑自身的活性也會隨時間的推移而略有下降， 但這些因素對于檢測的影響可忽略不計。

3.3 小結

研制了以固定入射光角度， 監測共振波長變化為操作模式的SPR分析儀， 儀器結構簡單、造價適中、宜于普及， 特別適于分子間相互作用的研究。應用SPR技術生物樣品無需標記， 且具有能實時監測反應動態過程、靈敏度較高、無背景干擾等特點。SPR分析儀的研制對SPR方法和儀器的發展及應用具有一定意義。

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Design and Development of Miniaturized Wavelength

Modulation Surface Plasmon Resonance Analyzer

SUN Ying， CAO Yan-Bo， WANG Xing-Hua， ZHANG Han-Qi， YU Ai-Min， SONG Da-Qian*

（College of Chemistry， Jilin University， Changchun 130012）

Abstract A miniaturized multi-wavelength modulation surface plasmon resonance （SPR） analyzer was developed by our laboratory. The incident angle of light was fixed and the change in the resonant wavelength was real-time monitored. The multi-wavelength measurement can be performed. The minor optic fiber spectrometer was designed and developed. The test light was input using optical fiber; the holographic diffraction grating was fixed for spectrophotometric; linear CCD optical sensor was used for detection. The wavelength range that can be detected is 500–900 nm and the resolution is 0.23 nm. The computer software of control sensor data acquisition and processing were self-developed. The experimental data were collected with the signal strength to the wavelength （the actual spectrum of horizontal and vertical coordinates）. The SPR analyzer is not only small， but also has good analytical performance for quantitative analysis of biomolecular interaction studies. The human immunoglobulin （IgG） was detected in real-time. With three different methods， the lowest concentration of 0.15 mgm/L of human IgG that can be detected. Meanwhile， the stability of the instrument， the effect on sample biological activity and other factors were also studied.

Keywords Surface plasmon resonance analyzer; Minor optic fiber spectrometer; Wavelength modulation

（Received 30 June 2011; accepted 20 August 2011）