四氨基酞菁鋅負(fù)載二氧化硅納米粒子的合成及其對(duì)細(xì)胞毒性的研究

摘 要 通過在無極核微乳液中水解乙烯基三乙氧基硅烷（TEVS）和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），制備了疏水性光敏劑-2，9，16，23-四氨基酞菁鋅負(fù)載的表面帶有正電荷的二氧化硅納米粒子（SiO2@ZnPc（NH2）4）。通過透射電鏡（TEM）、Zetasizer Nano-ZS粒度儀（DLS）、紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis）研究和表征了該納米粒子的表面形貌、表面電荷、水溶性和穩(wěn)定性。所合成的納米粒子粒徑約20 nm，顆粒為規(guī)則的球形，粒徑較均一， 具有很好的分散性，平均ζ電位值為（28.8±2.79 mV），在714 nm處有強(qiáng)吸收峰。此外，負(fù)載在納米粒子中的ZnPc（NH2）4不易泄漏，增強(qiáng)了ZnPc（NH2）4的抗光漂白能力。以1，3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）為探針分子，檢測(cè)出SiO2@ZnPc（NH2）4可以有效產(chǎn)生單線態(tài)氧。通過測(cè)量納米粒子與活細(xì)胞（HeLa， U251， PC-12）孵育后的細(xì)胞活度來檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示，納米粒子濃度≤300 mg/L時(shí)，未摻雜ZnPc（NH2）4的二氧化硅納米粒子（SiO2-NH2）對(duì)細(xì)胞沒有毒性；當(dāng)其負(fù)載ZnPc（NH2）4后，對(duì)細(xì)胞沒有顯著毒性。

關(guān)鍵詞 二氧化硅納米粒子； 四氨基酞菁鋅； 微乳液； 細(xì)胞毒性

1 引 言

近年來，光動(dòng)力治療（PDT）作為一種治療癌癥和黃斑變性等疾病的新興療法而備受關(guān)注[1，2]。PDT是通過特定波長(zhǎng)的光照射腫瘤組織，使富集于腫瘤組織中的光敏劑被激發(fā)，激發(fā)態(tài)光敏劑將能量傳遞給周圍的氧，生成活性很強(qiáng)的單線態(tài)氧，單線態(tài)氧與細(xì)胞內(nèi)的生物大分子（脂肪、核酸、氨基酸等）發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而使致病細(xì)胞壞死或凋亡[3]。而且，PDT在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常組織損害很小，從而通過控制光照輻射范圍，可實(shí)現(xiàn)對(duì)致病組織高效、有選擇性地治療。因此，光敏劑的研究在PDT的療效中顯得尤為重要。第二代光敏劑酞菁因其具有在紅外可見光區(qū)有強(qiáng)吸收，在非光照條件下毒性低，且產(chǎn)生單態(tài)氧效率高等優(yōu)點(diǎn)，在PDT中有良好的應(yīng)用前景[4，5]。然而，大部分光敏劑（如四氨基酞菁鋅（ZnPc（NH2）4），酞菁硅（IV）（Pc4）等）在生理?xiàng)l件下幾乎不溶于水，并且易形成聚集體，使其光動(dòng)力活性顯著降低，從而，限制了其在臨床中的應(yīng)用[6]。

由于二氧化硅納米粒子具有均一小孔、大的比表面積、良好的水溶性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)[7，8]，所以可作為藥物和基因的運(yùn)載體，在生物領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。然而，二氧化硅納米粒子對(duì)活細(xì)胞或生物體是否有毒性，結(jié)論尚不明確[9]。通常認(rèn)為二氧化硅納米粒子的生物毒性與其表面配體、粒徑和在溶液中的溶解度有關(guān)[10]。二氧化硅納米粒子的粒徑越小，在體內(nèi)循環(huán)阻礙越小，容易穿透細(xì)胞膜到細(xì)胞組織中，更適合在生物體內(nèi)應(yīng)用[11]。本研究利用可逆微乳液法，將ZnPc（NH2）4負(fù)載到二氧化硅納米粒子中，然后共價(jià)修飾氨基，制備了粒徑約20 nm的帶有正電荷的二氧化硅納米粒子（SiO2@ZnPc（NH2）4）；同時(shí)，制備了未摻雜ZnPc（NH2）4的二氧化硅納米粒子（SiO2-NH2）。利用透射電鏡（TEM）、Zetasizer Nano-ZS粒度儀（DLS）和紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis）對(duì)其進(jìn)行表征，并且考察了它的穩(wěn)定性和產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力。然后，研究了納米粒子對(duì)不同細(xì)胞（HeLa， U251， PC-12）的毒性。本研究為二氧化硅納米粒子在生物領(lǐng)域的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Hitachi H-600透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano-ZS粒度儀（英國(guó)Malvern公司）；Mini-1240紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；XS2酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；5415R高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；簡(jiǎn)易太陽光模擬光源（長(zhǎng)春博盛量子科技）。

乙烯基三乙氧基硅烷（TEVS，97%）和1，3-二苯基異苯并呋喃（DPBF，97%）購(gòu)自Aldrich公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，98%，F(xiàn)luka公司）；3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四氮唑（MTT，Sigma公司）； 2，9，16，23-四氨基酞菁鋅（ZnPc（NH2）4，黑龍江大學(xué)提供）；重水（英國(guó)Cambridge Isotope Lab）； 培養(yǎng)基（DMEM）和胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco公司）；Tween-80、正丁醇、氨水（25%）和二甲基甲酰胺（DMF）和其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭粚?shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ#8226;cm）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子的制備 采用改進(jìn)后的文獻(xiàn)[6，11]的方法，制備了ZnPc（NH2）4負(fù)載的二氧化硅納米粒子（SiO2@ZnPc（NH2）4）。室溫下，將20 mL Tween-80（2%， m/V）和600

SymbolmA@ L正丁醇混勻，然后加入80

SymbolmA@ L ZnPc（NH2）4（10 mmol/L DMF溶液），磁力攪拌20 min后，加入200

SymbolmA@ L TEVS，約1 h后加入20

SymbolmA@ L氨水。繼續(xù)攪拌30 min后，加入30

SymbolmA@ L APTES。以上混合物避光攪拌24 h后，用0.45

SymbolmA@ m纖維素半透膜進(jìn)行過濾，除去一些大的團(tuán)聚物，然后離心（13000 r/min，30 min）， 并且用超純水洗滌3次，以除去表面活性劑和未反應(yīng)的物質(zhì)。最后將得到的納米粒子分散在水中，4 ℃保存待用。為設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，同時(shí)制備了未摻雜ZnPc（NH2）4的二氧化硅納米粒子（SiO2-NH2）。

2.2.2 SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子的光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法，用朗伯-比爾定律求出SiO2@ZnPc（NH2）4 納米粒子中負(fù)載的ZnPc（NH2）4的近似濃度。然后以DMF為溶劑，分別配制5

SymbolmA@ moL/L SiO2@ZnPc（NH2）4和ZnPc（NH2）4溶液。以20 W碘鎢燈作為激發(fā)光源，分別對(duì)兩種溶液進(jìn)行照射，每隔2 min測(cè)量一次最大吸收波長(zhǎng)（714 nm）的紫外吸收強(qiáng)度，共測(cè)量36 min。

分 析 化 學(xué)第39卷

第10期莊欠粉等： 四氨基酞菁鋅負(fù)載二氧化硅納米粒子的合成及其對(duì)細(xì)胞毒性的研究

2.2.3 通過化學(xué)方法檢測(cè)單線態(tài)氧的產(chǎn)生

以DPBF[7，11]為探針分子，檢測(cè)SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力。DPBF可與單線態(tài)氧反應(yīng)產(chǎn)生更穩(wěn)定的鄰二苯甲酰基苯，通過測(cè)其在400 nm處的紫外可見吸收光強(qiáng)度檢測(cè)其產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力。將16.7

SymbolmA@ L 8 mmol/L DPBF-DMF溶液，加到1 mL 5

SymbolmA@ mol/L SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子重水溶液中，空白實(shí)驗(yàn)采用SiO2-NH2納米粒子重水溶液；分別用633.5 nm 波長(zhǎng)的光進(jìn)行照射，以納米粒子重水溶液作為背景，每分鐘檢測(cè)一次400 nm處的紫外吸收強(qiáng)度。

2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與毒性檢測(cè)

將HeLa細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）、U251細(xì)胞（人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞）、PC-12細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞）懸浮液分別接種到96孔板中，細(xì)胞密度大約為1.2×104 個(gè)/孔，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（5% CO2，37

SymbolpB@ C）。將SiO2@ZnPc（NH2）4和SiO2-NH2納米粒子分別溶入培養(yǎng)基（DMEM）中，配制濃度為20， 50， 100和300 mg/L的溶液，超聲30 s，使納米粒子分散。將孔板中舊培養(yǎng)基（DMEM＋10% FBS）去除，加入100

SymbolmA@ L配制好的納米粒子溶液；空白實(shí)驗(yàn)加入等量不含任何納米粒子的DMEM。反應(yīng)4 h后，每孔加入10

SymbolmA@ L血清，在培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)48 h，進(jìn)行毒性檢測(cè)。

采用MTT比色法分析細(xì)胞毒性[13]。將舊培養(yǎng)基取出，用DMEM洗滌3次；每孔加入10

SymbolmA@ L 5.0 g/L MTT的PBS溶液和90

SymbolmA@ L培養(yǎng)基，4 h后取出孔板中溶液，加入150

SymbolmA@ L DMSO溶解紫色結(jié)晶塊。用酶標(biāo)儀測(cè)量每孔在波長(zhǎng)555 nm處的吸收光度。相對(duì)細(xì)胞活率（%）為納米粒子孵育的細(xì)胞與空白細(xì)胞的紫外可見吸收光度的比值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍，以保證重現(xiàn)性。

3 結(jié)果與討論

3.1 納米粒子的表征

3.1.1 納米粒子的尺寸和形狀 選取Tween-80為表面活性劑，利用可逆微乳液法將疏水藥物ZnPc（NH2）4包進(jìn)硅膠中[6，11，14]，再修飾氨基，制備了SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子；同時(shí)制備了未負(fù)載ZnPc（NH2）4的二氧化硅納米粒子（SiO2-NH2）。TEM圖（圖1）顯示，所合成的納米顆粒為規(guī)則的球形， 粒徑較均一， 具有很好的分散性。

3.1.2 納米粒子表面電荷的測(cè)量 將納米粒子溶入水中，超聲30 s，用Zetasizer Nano-ZS粒度儀測(cè)量ζ電位。SiO2-NH2和SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子的平均ζ電位分別為（26.5±1.90）mV和（28.8±2.79）mV。文獻(xiàn)[10]中，粒徑為20～25 nm的帶有氨基的二氧化硅納米粒子的ζ電位值為5.35 mV。這可能是由于實(shí)驗(yàn)加入較多的APTES，使納米粒子表面的氨基增多，從而使得納米粒子表面正電荷增加。納米粒子表面帶有大量的正電荷，對(duì)細(xì)胞具有更大的親合力。

3.1.3 納米粒子的光譜表征 ZnPc（NH2）4水溶性很差，其水溶液在紫外可見光區(qū)幾乎沒有吸收。ZnPc（NH2）4易溶于DMF，于是先將其溶于DMF，然后再用水稀釋，隨后測(cè)其紫外可見吸收光譜。如圖2所示，相同濃度（5

SymbolmA@ mol/L）的ZnPc（NH2）4（0.025% DMF/水）溶液和SiO2@ZnPc（NH2）4水溶液的

光譜有很大差別。0.025%的DMF/水溶液中的紫外可見吸收較弱，當(dāng)其被摻雜到二氧化硅納米粒子中以后，在350和714 nm處出現(xiàn)了兩個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，表明將ZnPc（NH2）4摻雜到二氧化硅納米粒子中后，ZnPc（NH2）4 的水溶性提高。

3.2 納米粒子的穩(wěn)定性表征

3.2.1 納米粒子染料泄露實(shí)驗(yàn) 將ZnPc（NH2）4負(fù)載到生物相容性好的二氧化硅納米粒子中，可以增加其水溶性和靶向性，使ZnPc（NH2）4更易進(jìn)入靶細(xì)胞。文獻(xiàn)[15]報(bào)道，將染料摻雜到納米小球中易泄漏。如果本實(shí)驗(yàn)制備的納米粒子穩(wěn)定性不佳，摻雜的ZnPc（NH2）4很快就從納米粒子中泄漏，那么ZnPc（NH2）4的水溶性無法得到改善，也無法被納米粒子轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中，從而降低PDT療效。為了驗(yàn)證納米粒子是否泄漏，將制備的納米粒子溶入水中，保存一個(gè)月后，將其用水洗滌3次，測(cè)紫外可見吸收光譜。發(fā)現(xiàn)SiO2@ZnPc（NH2）4的吸收強(qiáng)度下降程度小于10%。此結(jié)果表明，納米粒子中摻雜的ZnPc（NH2）4不易泄漏，具有很好的穩(wěn)定性。

3.2.2 納米粒子的光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 光敏劑在PDT中可能會(huì)發(fā)生光漂白，而使其紫外可見光和熒光強(qiáng)度減弱[16]。將ZnPc（NH2）4負(fù)載到二氧化硅納米粒子中， 圖3 SiO2@ZnPc（NH2）4和ZnPc（NH2）4的光穩(wěn)定性曲線

Fig．3 Photostability curves of SiO2@ZnPc（NH2）4 and ZnPc（NH2）4

由于二氧化硅殼層的保護(hù)作用，有效降低和減緩了外界光源對(duì)ZnPc（NH2）4的光漂白，而使其PDT療效提高。如圖3所示，用碘鎢燈照射36 min后，SiO2@ZnPc（NH2）4溶液紫外吸收光度下降程度小于9.5%，而ZnPc（NH2）4紫外吸收光度下降程度大于68%；這說明ZnPc（NH2）4被包進(jìn)納米粒子中后，抗光漂白能力增強(qiáng)，光穩(wěn)定性提高。

3.3 檢測(cè)SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子單線態(tài)氧的產(chǎn)生

單線態(tài)氧是一種活性氧分子，可與細(xì)胞內(nèi)的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，從而將致病細(xì)胞殺死。因此，單線態(tài)氧在PDT治療中具有重要作用。以DPBF為探針分子，通過化學(xué)方法檢測(cè)制備的納米粒子是否可釋放出單線態(tài)氧。如圖4所示，經(jīng)633.5 nm的可見光照射一段時(shí)間之后，SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子重水溶液中的DPBF在400 nm處的紫外吸收光強(qiáng)度明顯減弱，這表明SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子有較好的產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力，并且單線態(tài)氧可以從納米粒子中釋放出來，與溶液中的DPBF反應(yīng)，使其發(fā)生光漂白。SiO2-NH2納米粒子重水溶液中的DPBF在400 nm的紫外吸收強(qiáng)度基本沒有變化，表明DPBF的光漂白與ZnPc（NH2）4產(chǎn)生的單線態(tài)氧有關(guān)。

3.4 細(xì)胞培養(yǎng)與毒性檢測(cè)

理想的光敏劑不僅可有效地產(chǎn)生單線態(tài)氧，而且在非光照條件下低毒或無毒，只有這樣才不至于使健康細(xì)胞受到損傷，從而達(dá)到高效、選擇性地對(duì)致病組織進(jìn)行PDT治療的目的。因此，本研究以3種癌細(xì)胞HeLa， U251和PC-12為例，在非光照條件下，考察SiO2@ZnPc（NH2）4和SiO2-NH2納米粒子對(duì)3種癌細(xì)胞的毒性。將不同濃度的SiO2@ZnPc（NH2）4和SiO2-NH2納米粒子與3種細(xì)胞避光培養(yǎng)48 h，通過MTT比色法分析納米粒子對(duì)細(xì)胞的毒性，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)納米粒子濃度為300 mg/L時(shí)，SiO2-NH2納米粒子對(duì)3種癌細(xì)胞均基本沒有毒性； 圖5 不同二氧化硅納米粒子的細(xì)胞活性分析

Fig．5 Cell viability assay with different silica nanoparticles而SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子對(duì)HeLa細(xì)胞和U251細(xì)胞有輕微的影響，細(xì)胞相對(duì)存活率約為90%，對(duì)PC-12細(xì)胞基本沒有毒性。當(dāng)納米粒子濃度≤300 mg/L時(shí)，兩種納米粒子對(duì)細(xì)胞基本沒有毒性。

4 結(jié) 論

利用可逆微乳液法制備了SiO2@ZnPc（NH2）4和SiO2-NH2納米粒子。制備的納米粒子顆粒呈規(guī)則的球形，單一分散，具有良好的水溶性，生物相容性和穩(wěn)定性；并且SiO2@ZnPc（NH2）4納米粒子產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力較好。將納米粒子和3種癌細(xì)胞（HeLa， U251和PC-12）避光孵育，研究非光照條件下納米粒子對(duì)細(xì)胞的毒性，當(dāng)SiO2@ZnPc（NH2）4和SiO2-NH2納米粒子濃度≤300 mg/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞基本沒有毒性。本實(shí)驗(yàn)為二氧化硅納米粒子在藥物和基因的運(yùn)載體系等方面的應(yīng)用提供了基本信息，為其在PDT治療方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。

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Preparation of Tetraamino-Phthalocyanine Zinc Loaded Silica

Nanoparticles and Its Cytotoxicity Study

ZHUANG Qian-Fen1，2， WANG Jin-E1， ZHU Zhi-Jun1， LI Feng2， WANG Zhen-Xin1

1（State Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry， Changchun Institute of Applied Chemistry，

Chinese Academy of Sciences， Changchun 130022）

2（College of Chemistry and Molecular Engineering， Qingdao University of Science and Technology， Qingdao 266042）

Abstract Positive charged silica nanoparticles， entrapping hydrophobic photosensitizer 2，9，16，23-tetraamino-phthalocyanine zinc （ZnPc（NH2）4）， have been synthesized in the nonpolar core of micelles by hydrolysis of triethoxyvinylsilane （TEVS） and 3-aminopropyltriethoxysilane （APTES）. The water-soluble， stability， surface morphologies and charge were characterized using transmission electron microscopy （TEM），dynamic light scattering （DLS） and UV-visible spectrophotometer. The as-prepared nanoparticles are highly monodispersed spheres with uniform diameter （about 20 nm）， and stable in aqueous system. Its average ζ potential value is 28.8±2.79 mV and exhibits strong absorption peak at 714 nm. In addition， encapsulation of ZnPc（NH2）4 in the silica nanoparticles prevented ZnPc（NH2）4 from leaking and enhanced the anti-photobleaching. The ZnPc（NH2）4 entrapped-nanoparticles （SiO2@ZnPc（NH2）4） can efficiently generat singlet oxygen as measured by chemical probe 1，3-diphenylisobenzofuran （DPBF）. The toxicity of silica nanoparticles to cells has been investigated by the incubation of the ZnPc（NH2）4 entrapped-nanoparticles and the nanoparticles without ZnPc（NH2）4 （SiO2-NH2） with living cancer cells （HeLa， U251， PC-12）. The experimental result reveals that both SiO2@ZnPc（NH2）4 and SiO2-NH2 particles have no significant toxicity when the concentration of the particles is below 300 mg/L.

Keywords Silica nanoparticles; Tetraamino-phthalocyanine zinc; Microemulsion; Cytotoxicity

（Received 2 March 2011; accepted 18 May 2011）