基于芯片介電電泳的細胞特性分析及種類判斷

摘 要 基于微流控芯片介電電泳（Dielectrophoresis， DEP）原理和技術，在自行設計制作的拋物線電極結構的微流控介電電泳芯片上，采用芯片介電泳臨界頻率測定法，選擇緩沖液電導率為200～1000 SymbolmA@ S/cm，激發電壓為5 V，分別對紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）和死活HepG2肝癌細胞的臨界頻率進行了測試，檢測相對誤差小于5%（n＝5），并對表征細胞生物狀態的膜電導和膜電容進行了參數提取和分析。結果表明: 不同種類的細胞及不同活性程度的細胞的細胞電學參數差異明顯。利用本方法實現了對細胞種類及生物活性的定性判斷和分析。

關鍵詞 介電電泳； 臨界頻率； 膜電容； 膜電導

1 引 言

電化學測試技術以其高靈敏度和高集成性在細胞分析中顯示出突出的優勢，通過細胞電學參數的變化區分細胞及其生物活性具有重要的研究價值和實用意義。陳曉敏等[1]采用阻抗分析儀，在0.01～100 MHz范圍內，測量了正常人血液細胞的介電譜，并對正常人血液細胞介電常數進行了相關分析。Cai等[2]在360 pL的微腔體內對心肌單細胞進行實時電流檢測，通過在微腔體中布置的兩個微電極，實現了單細胞的安培電學在線檢測。該課題組還通過微電極測定了單個細胞的電活性，利用電學性質分析了單細胞中離子和代謝物[3]。Huang等[4]通過微流控管道運輸和定位單細胞，用煙堿刺激細胞，使其釋放多巴胺，并通過安培檢測對釋放的多巴胺進行了定量分析，通過電學方法實現了細胞的定量分析。Son等[5]設計了一種可以多次使用的安培檢測芯片，利用血色素A1c電學特性進行檢測分析。Wang等[6]利用介電電泳技術研究了HL-60細胞凋亡早期的介電性質差異。龍泉等[7]通過實時電旋芯片檢測分析了JurKat細胞的凋亡，并研究了細胞胞膜性質隨細胞凋亡過程的變化。這些研究顯示了電學參數在細胞分析方面的重要應用，但其多是通過細胞溶液的介電性質進行分析，對微體系中細胞操縱的問題研究較少，對細胞本身的電學參數方面缺少分析，未能實現細胞相關特性的分析。

本研究利用微流控介電電泳（Dielectrophoresis， DEP）技術實現細胞操縱和控制，利用細胞的不同介電電泳特性，通過臨界頻率法，提取細胞胞膜電容和膜電導參數，對提取的細胞電學參數在細胞種類及其生物活性方面的意義和應用進行探討。利用微流控DEP芯片分析方法獲得細胞的電學參數，為醫療診斷、食品安全、環境監測、藥物/基因篩選，及細胞生物學和神經系統科學等研究提供有用信息。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

OLYMPUS IX71顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；33220A交流信號發生器（美國安捷倫科技有限公司）；TGL-16離心機（鞏義市英峪予華儀器廠）；senlION5便攜式電導儀（美國哈希公司）；KQ-50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；血球計數板。實驗所用試劑均為國產分析純。

2.2 微流控DEP細胞分析芯片系統

2.2.1 DEP芯片 實驗采用DEP芯片測定細胞進行介電電泳時的臨界頻率，同時用顯微鏡觀察微流控芯片上細胞DEP行為。為了保證細胞的正、負DEP行為得到清晰觀察，使細胞DEP性質得到準確判斷，采用拋物線電極結構的DEP基片（圖1）。選擇石英作為金屬電極的基片材料，DEP基片上微拋物線電極通過掩膜的制作、 圖1 拋物線型DEP芯片

Fig．1 Dielectrophoresis （DEP） microchip with parabolic electrodes薄膜沉積和微圖形加工3個典型的MEMS加工步驟獲得。蓋片采用帶有微腔體的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）片，其由聚二甲基硅氧烷通過澆注法制得。將PDMS蓋片和拋物線微電極的DEP基片對位鍵合，構成實驗用復合式DEP芯片。在靜態停流狀態下對細胞的DEP行為進行觀察，以確定所選定細胞樣本的臨界頻率。

2.2.2 微流控DEP芯片分析系統 自行搭建了微流控DEP芯片分析系統，用于細胞的參數提取和分析。系統主要由交流信號發生器、倒置顯微鏡、CCD成像系統、微流控DEP芯片和計算機組成。交流信號發生器施加激發信號，使得微流控DEP芯片上的分析細胞樣品產生介電電泳行為，通過顯微鏡及CCD成像系統觀察芯片上的細胞行為，同時采集圖像信號（圖2）。

2.3 樣品處理

將HpeG2肝癌細胞（重慶醫科大學附屬第二醫院提供）懸液以1000 r/min離心5 min，去除上清液；加入緩沖液，再次離心，如此3次，即得實驗用HepG2癌細胞。紅細胞取自健康人血液2 mL，置于10 mL離心管中，以2000 r/min離心10 min， 去除上清液，加入緩沖液，再次離心，如此3次，即得實驗用紅細胞。 圖2 集成DEP微流控分析系統

Fig．2 Scheme of integrated DEP microchip system吸取2 mL白細胞（重慶醫科大學附屬第二醫院提供）分離液于10 mL離心管，加入2 mL新鮮血液，以2000 r/min離心20 min，用移液管將分層后的白細胞移入裝有緩沖液的10 mL離心管中，以2000 r/min離心20 min，即得實驗用白細胞。實驗用死癌細胞的制備，取部分處理好的活肝癌細胞，在60 ℃中加熱5 min即得，用0.1% 臺盼藍染色死肝癌細胞，以便對死、活癌細胞進行顯微觀測。

緩沖液配制：采用8.5%蔗糖和0.3%葡萄糖溶液作為緩沖介質，用電導率儀測定懸浮液的電導率，以PBS調節成實驗所需的電導率。

2.4 細胞臨界頻率測定

實驗利用拋物線電極結構的DEP芯片及其系統，分別以紅細胞、白細胞和HepG2肝癌細胞為樣品，對它們在不同電導率緩沖液中的介電電泳臨界頻率進行測量。在課題組前期研究[8～10]的基礎上，DEP激發電壓選擇為5 V，緩沖液電導率分別選擇為200， 400， 600， 800 和1000

SymbolmA@ S/cm，通過改變激發頻率，測定3種細胞的臨界頻率。

為了進行細胞生物活性的定性分析，對死、活HepG2肝癌細胞在上述電導率的緩沖溶液中的臨界頻率進行了測定。

依據細胞本身的特性，結合實驗所提取出的各細胞胞膜電容（Cmem）和膜電導（Gmem）等參數的差異，對不同種類的細胞進行定性分析。對同種細胞的不同生物活性狀態下的參數進行提取，通過對其胞膜電容和膜電導的分析，可實現對其生物活性的分析和判斷。

3 結果與討論

3.1 細胞特性及種類判斷分析方法

介電電泳是在非均勻電場中，利用微粒由于結構、形態、組成等不同所導致的介電性質的差異，對微粒進行操縱的技術。細胞所受到的介電電泳力可表示為：

FDEP＝2πr3εmRe（fCM）E2（1）

其中，FDEP為細胞所受的介電電泳力，r為細胞半徑，εm為緩沖介質的介電常數，Re（fCM）為Clausius-Mosotti因子的實部，為拉普拉斯算符，E為場強。FDEP大小和正負性由微粒與緩沖介質的相對極化率決定，通過調節激發頻率可以改變相對極化率。當兩者極化率相當時，Clausius-Mosotti因子為零。此時處于非均勻電場中的微粒受到的介電電泳力為零，將此時施加的外電場頻率定義為臨界頻率，即零點頻率。細胞的臨界頻率間接反應了細胞的介電性質，通過研究細胞的臨界頻率可以對細胞介電參數進行研究。在所設計的金拋物線電極的DEP芯片測試區域，可將細胞視為橢圓的球體。以橢圓單殼模型進行擬合，通過測試介電電泳臨界頻率進行細胞Cmem和Gmem參數提取和分析[6]。

已有研究顯示，當緩沖介質的電導率σm滿足0.01 S/m<σm<0.2 S/m時，以細胞緩沖介質電導率為橫坐標，細胞半徑乘以其對應緩沖介質中的臨界頻率為縱坐標，得出的曲線r×fcrossover～σm線性關系良好[6，11]。而同時細胞膜電容和膜電導則是關于該線性曲線的斜率和截距的方程，具有如下關系[12，13]：

Cmem＝22π×Slope（2）

Cmem＝4×intercptSlope×r（3）

其中，r為細胞半徑，slope為曲線r×fcrossover～σm的斜率，intercept為該曲線在橫軸的截距絕對值。可見，通過測定不同電導率緩沖介質下細胞的臨界頻率，可以分析得出細胞膜電容Cmem和膜電導Gmem，并以此作為細胞生物活性狀態分析和判定的依據。

3.2 細胞臨界頻率測定

3.2.1 紅細胞、白細胞和肝癌細胞臨界頻率測試 實驗通過施加不同頻率的激勵信號改變細胞所受的介電泳力的性質，可有效測定出細胞的臨界頻率（表1～3）。在顯微鏡下，可觀察不同細胞所體現的不同性質介電電泳行為特征（圖3）。

式中，σm為緩沖液電導率，對于同一細胞樣品，Cmem和Gmem為定值。顯然，當緩沖液電導率增大，細胞的臨界頻率也會隨之增大，表1的實驗結果與此相符。由于紅細胞沒有細胞核，且為扁平的橢圓結構，而白細胞和癌細胞均有細胞核且為球形，紅細胞與白細胞和HepG2肝癌細胞在結構和形態上存在較大的差異。實驗表明，當緩沖液電導率為200

SymbolmA@ S/cm緩沖介質時，紅細胞與另外兩種細胞的臨界頻率差距均已超過100 kHz；當緩沖液電導率達到800

SymbolmA@ S/cm，紅細胞與白細胞的臨界頻率差距300 kHz，與HepG2肝癌細胞差距500 kHz。白細胞和HepG2肝癌細胞在低電導率緩沖介質中的臨界頻率差距并不大; 但是隨著緩沖介質電導率的增加，差距逐漸加大; 當緩沖介質電導率大于600

SymbolmA@ S/cm時，兩者的臨界頻率差距超過100 kHz。在不同緩沖液電導率中，細胞臨界頻率體現出不同的變化趨勢，其中胞膜電容和膜電導起著重要作用。本研究利用此變化趨勢的差異對各細胞的電學參數進行了定性分析。

3.2.2 死、活肝癌細胞臨界頻率測試 在60 ℃高溫下，將活的肝癌細胞滅活5 min，并用臺盼藍染色劑將死細胞染成藍色，以便于觀察和區分。死、活HepG2肝癌細胞在DEP芯片上的正、負介電電泳的實驗結果如圖4所示。 圖4 死活肝癌細胞正、負介電電泳

Fig．4 Photographs of pDEP（a，c） and nDEP（b，d） movement of inviable and viable HepG2

在電導率為200， 400， 600， 800和1000

SymbolmA@ S/cm緩沖介質中，測得死（表4）、活（表3）癌細胞臨界頻率。實驗所采用的HepG2癌細胞其死活狀態的臨界頻率顯示出明顯的差異。

3.3 細胞參數提取及定性分析

實驗在放大倍數為400倍條件下，對紅細胞、白細胞和活肝癌細胞和死肝癌細胞的尺寸進行測定，結合臨界頻率測定時得到的實驗結果，繪制出fcrossover×r-σm曲線（圖5），并得出各自的線性回歸方程。其中fcrossover為細胞臨界頻率，r為細胞半徑，σm為緩沖液電導率；

3.3.1 紅細胞、白細胞、HepG2肝癌細胞定性分析 HepG2肝癌細胞無限增殖的特點決定了其蛋白質、核酸等的合成異常旺盛，相反分解代謝則顯著降低。紅細胞主要用于體內氧氣的運輸和CO2的排泄，白細胞作為免疫細胞，主要功能就是抵御外來細胞和病菌的侵擾。不同細胞具有不同的功能，其細胞膜的成分也存在較大差異，細胞膜電容和膜電導也就不同。通過對紅細胞、白細胞和HepG2肝癌細胞的膜電容和膜電導參數的提取（表5），能從細胞膜電學參數及性質的角度對細胞的種類進行定性分析。

3.3.2 死、活HepG2肝癌細胞的定性分析 細胞膜是由含有大量蛋白質的脂質雙分子層組成，不僅薄而且高度絕緣，其膜電容主要由細胞膜的厚度、成分及胞膜形態決定，而膜電導則是表征細胞內外凈粒子交換的參數。當細胞死亡后，細胞膜失去作用，胞內物質能夠自由與胞外物質進行互換，胞膜電導增加。對于同種細胞而言，當處于對細胞不利的環境，如在腫瘤細胞懸液中加入抗腫瘤藥物或者在正常細胞懸液中加入毒素，細胞的生理狀態必將發生變化。此時細胞膜的成分和形態發生變化，細胞膜電容也隨之改變。如果細胞死亡，則細胞膜將會失去選擇特性，此時其膜電導必然增加，這反映了細胞膜電容和膜電導在細胞生物活性定性研究方面的重要作用，利用這一特性能夠定性分析細胞活性。利用此特性通過提取細胞胞膜電容和膜電導參數，對死、活HepG2肝癌細胞進行了定性分析（表6）。

HepG2肝癌細胞的膜電容與紅細胞和白細胞相比大得多，利用這種差異便能夠從膜電容對細胞的種類進行定性判別。白細胞和紅細胞的曲線斜率相差很小，表明二者的臨界頻率與半徑的乘積隨緩沖液電導變化的幅度接近，雖然計算得到的膜電容Cmem差異較小，但它們膜電導差異卻很大。3種細胞的膜電導差異都較大，可以通過提取的膜電導參數進行紅細胞、白細胞和肝癌細胞的定性研究。

4 結 論

利用微流控芯片介電電泳原理和技術，通過臨界頻率法對細胞的膜電容和膜電導進行提取分析，從細胞胞膜本身的電學性質差異對細胞種類及其生物活性狀態進行定性研究。在緩沖液電導率為200～1000

SymbolmA@ S/cm，激發電壓為5 V條件下，獲得了白細胞、紅細胞、活肝癌細胞和死肝癌細胞胞膜電容和電導，有效地實現對細胞電學參數的提取，并由細胞的電學參數，定性分析了細胞種類及其生物活性程度。

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Cell Characters Analysis and Type Identification on

Dielectrophoresis Microchip

WU Yong-Jie1，2，3， XU Yi1，2，3，4， PENG Jin-Lan1，2.3， CAO Qiang1，2.3， ZENG Ping1，

（ 1Chemistry and Chemical Engineering College， Chongqing University，

2Key Disciplines Lab of Novel Micro-nano Devices and System Technology，

3International R D Center of Micro-nano Systems and New Materials Technology，

4Microsysten Research Center， Chongqing 400030）

Abstract On the basis of the principle and technology of microfluidic chip dielectrophoresis （DEP）， crossover frequencies of red blood cell （RBC）， white blood cell （WBC） and HepG2 were tested on a homemade parabolic electrode dielectrophoresis microfluidic chip when the conductivity of the buffers was in the range of 200－1000

SymbolmA@ S／cm and the applied excitation voltage at 5 V. Five parallel experiments were carried out and the relative error was less than 5%. Then， membrane conductance （Cmem） and membrane capacitance （Gmem） were calculated and analyzed. The result showed that electrical parameters of different types of cells and different levels of activity of cells were of great difference. In this study， the cell types and its biological activity was studied by using the cell DEP crossover frequency testing method.

Keywords Dielectrophoresis; Crossover frequency; Membrane conductance; Membrane capacitance

（Received 18 January 2011; accepted 10 May 2011）