便攜式三聚氰胺快速檢測儀的研制與應用

摘 要 自主研發了便攜式三聚氰胺速檢儀， 利用納米增敏表面增強拉曼光譜法， 定量檢出限為0.5 mg/kg；采用相對測量方式可有效克服測量不穩定性。用于原奶、消毒奶、酸奶、奶粉中三聚氰胺檢測， 線性關系良好。樣品前處理步驟簡單。通常情況， 平均單樣檢測時間小于2 min， 儀器檢測時間小于30 s， 尤其適用于現場快速分析。除了可應用于乳及乳制品中三聚氰胺含量速測外， 還成功用于橄欖油中摻假成分快速鑒別、養殖水中孔雀石綠快速檢測。

關鍵詞 三聚氰胺；納米增敏；表面增強， 拉曼光譜法

1 引 言

三聚氰胺毒牛奶事件對中國乳制品業造成了巨大沖擊。為加強乳制品質量監管， 確保乳及乳制品食用安全， 2008年10月國家頒布并實施了《乳制品監督管理條例》。2010年10月國家質檢總局發布《企業生產乳制品許可條件審查細則》（2010版）， 強調企業在購入生乳原料和原料乳粉及其加工制品時需批批檢測三聚氰胺含量， 必須具備三聚氰胺檢測能力[1]。2011年4月6日， 衛生部會同質檢總局等五部門聯合發布了食品中三聚氰胺限量值公告（2011年10號）， 規定：嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg， 其它食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg[2]。

根據國標GB22388-2008規定， 三聚氰胺檢測方法為高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS）、氣相質譜-質譜/聯用方法（包括氣相色譜質譜法GC-MS和氣相色譜-質譜/質譜法GC-MS/MS）[3]。鑒于上述方法需在實驗室進行， 檢測成本高， 分析速度慢， 《審查細則》規定: 企業可以使用經相關部門認定的快速檢驗設備， 但檢驗結果呈陽性時， 應使用食品安全國家標準檢驗方法進行確認。因此， 對快速檢測技術提出了急迫的市場需求。

拉曼散射光譜是一種根據物質特征結構所特有的拉曼特征信號進行鑒別和測量的光譜分析技術。20世紀90年代后期， 拉曼技術開始應用于生物化學、安全檢查、精密加工、珠寶文物鑒定、醫藥檢測等眾多領域[4～6]， 并從最初簡單定性研究轉向定量分析[7～9]， 具有簡便、快速、無損、成本低廉等優勢， 利用表面增強拉曼散射（SERS）[10]技術， 可使普通Raman光譜靈敏度提高104～1014， 可滿足現場快速檢測要求。

本文介紹了JZ-1型三聚氰胺快速檢測儀， 基于高可靠性的固定式非光纖集成拉曼光路設計， 集成控制和專用數據分析系統， 配合專利銀膠增敏試劑， 具有我國自主知識產權[11～14]。儀器及配套試劑， 利用表面增強拉曼光譜檢測技術實現乳及乳制品中三聚氰胺快速定量分析， 定量下限為0.5 mg/kg， 儀器檢測時間小于30 s。該速檢儀便攜、操作簡便、運行成本低。可滿足企業原料收購、生產質量控制等需求， 也為質檢部門現場執法提供了快速檢測技術手段。

2 儀器主要技術指標和特性

2.1儀器的主要技術指標

該儀器由中國檢驗檢疫科學研究院研制， 并與威海威高電子工程有限公司聯合開發， 基于納米增敏表面增強拉曼光譜檢測方法[7，12]， 主要技術指標如下。

定量下限： 0.5 mg/kg；檢測誤差＜10%；單樣檢測時間 ＜30 s；激光波長：785 nm；光譜檢測范圍：200～3000相對波數；光譜分辨率：＜13 cm－1；工作溫度：10～30 ℃；外形尺寸：270×230×115 mm；集成數據處理系統， 6.4英寸觸摸屏輸入， 帶有2個USB接口。

2.2 光學設計

傳統檢測光路， 整個光機結構設計需要對每個器件進行定位、調整， 結構復雜、穩定性差， 不便于檢測儀器的現場應用、維護和維修。現有國外便攜式激光光譜分析儀器多采用光纖耦合技術， 由于光纖光路耦合效率低， 會使光能量有較大損失， 且受到光纖彎曲、移動等因素的干擾， 其穩定性差， 不適于高靈敏拉曼光譜檢測的需要。針對以上問題， 對于儀器光學系統設計， 沒有參照國外便攜式拉曼光譜檢測儀器的光纖結構， 而是采用了固定光路結構。通過對光機元件的優化， 僅通過對反射鏡的調節即可完成光路調校， 校準鎖定后光路穩定可靠， 在使用前無需再次對光路進行調節。

為了保證儀器光路系統的穩定， 儀器設計了專用的反射鏡架。反射鏡架的固定和調節采用了頂拉結合方案， 利用精密數控加工技術的優勢， 對光具架進行了一體化改進， 以預留的鏈接梁和兩對頂絲和螺絲對光具座動板進行控制和固定。兩對頂絲和螺絲分別設置在鏈接梁的軸向和垂直軸向上， 可以單獨控制動板的水平和俯仰調整。當螺絲和頂絲鎖死后， 將使動板形成三點固定的穩固結構。整機以30°傾角對儀器4個方向進行底面跌落實驗， 光譜信號衰減＜10%。

整個儀器的光學系統以光學底板為基準， 預先在底板上經精密數控加工出定位槽， 保證各部件的安裝精準。這一設計使光路中光學元件的定位和更換非常簡單， 大大提高了儀器的可維修性。儀器外觀和光學結構見圖1。

2.3 儀器控制系統

儀器控制電路分為兩個部分：電源部分和控制系統， 其原理圖如圖2。電源部分設計中將用于激光器供電的模擬電源和用于控制部分 圖2 儀器控制原理圖

Fig．2 Schematic diagram of control system供電的數字電源分離， 以防止數字信號對激光輸入產生干擾。儀器控制電路采用基于X86體系的控制板構架， 工作頻率500 MHz， 256 M內存， 通過USB端口控制觸摸屏和光譜儀， 控制板以工業CF卡作為外存儲器， 并留有兩個USB2.0端口， 可用于數據備份和連接打印機。

2.4 信號處理和操作界面

為了提高儀器檢測速度和使用便捷性， 儀器設計要求在使用中無須對光路進行調整。然而對于每個樣品其放置位置的微小差異， 以及其它環境因素都會使檢測光譜發生強弱變化， 會導致信號發生與待測信號無關的波動。為了解決這一問題， 儀器在信號處理上采用了三聚氰胺信號（709 cm－1）對乳品本身928 cm－1信號歸一的方法， 經過歸一的信號克服了外界因素對測量的影響， 使測量穩定性得到提高， 為定量檢測奠定了基礎。

儀器采用嵌入式分析控制系統， 無需外接計算機。將檢測過程控制、光譜信號處理、光譜分析及數據分析等功能進行封裝， 儀器操作界面簡潔、明確。根據實際檢測需要儀器軟件設計了標準曲線擬合、安全提示、操作員管理、誤操作提示、檢測結果自動報表、檢測超標數據自動告警等功能。盡可能根據實際使用需求提高儀器的可操作性和便捷性。根據標樣計算儀器的校準曲線， 并給出標線擬合公式及線性相關系數。圖3為儀器生成的檢測記錄， 以列表形式提供檢測記錄編號、檢測濃度、檢測時間、操作員代碼、標準曲線代號等信息， 并對超標數據提供指示。檢測記錄可以方便回放檢查， 記錄還可以通過USB接口導出進行備份， 適合質量管理和過程追溯的要求。

2.5 樣品前處理和儀器的操作

儀器檢測只需進行以下步驟：（1）樣品前處理 量取1.0 mL試樣于10 mL離心管中， 加入4.0 mL水， 渦旋混勻；量取其中1 mL勻質試液于1.5 mL離心管中， 以不低于5000 g離心3～5 min， 取清液待測；（2）加樣 取250

SymbolmA@ L檢測試劑A于2 mL的樣品池中， 加入150

SymbolmA@ L檢測試劑B， 小心吸取待測清液100

SymbolmA@ L于樣品池中， 使用渦旋振蕩器混勻；（3）測試 將樣品放入檢測室， 點擊“測試”即開始檢測， 約10 s后即可顯示結果。 應注意的是， 檢測和加樣過程應盡量連貫操作， 以保證測試結果的一致性。全程分析時間（包括樣品前處理和測試）僅需5～6 min， 檢測速度遠遠高于HPLC等方法。

3 結果與討論

3.1 儀器耦合效率比對為了驗證儀器光學系統效率， 以乙腈標品和2.5 mg/kg三聚氰胺純牛奶樣品為檢測對象， 將儀器與國外便攜式拉曼光譜儀器（光纖結構， 制冷CCD光譜儀）進行比對。如圖4所示， 針對同一樣品（乙腈）， 積分時間均設置為3 s， 均經過暗背景扣除， 本儀器信號強度約為國外儀器的2倍， 而背景噪聲卻更低， 即表明對拉曼光譜的耦合效率優于對比的儀器。

圖5為2.5 mg/kg三聚氰胺原奶樣品檢測結果的比對。兩儀器設置采樣時間相同， 試劑相同， 其它設置與乙腈實驗相同。可見，本儀器于波數709 cm－1附近的三聚氰胺檢測信號已足夠強， 而對比儀器三聚氰胺信號尚達不到測量要求。當比對儀器積分時間設置為20 s時， 三聚氰胺信號強度方達到本儀器水平。兩組實驗表明， 通過光學系統的合理設計， 儀器具有靈敏度高、可靠性好、便于維修和使用等特點。

3.2 重復性測試

考慮到乙腈光譜簡單， 幾乎沒有背景干擾， 測量結果受其它因素影響少等特點， 以乙腈標品為測量對象考察儀器測量的重復性。為了考察儀器自歸一測量性能， 以乙腈378 cm－1處信號對928 cm－1處信號進行歸一， 經過25次重復測試。測量平均值為1.596；標準差：0.007；相對標準偏差為0.5%。重復第一組實驗， 但每次操作均將樣品取出并重新裝入儀器， 測量平均值為1.598；標準差: 0.010; 相對標準偏差0.6%。由以上兩組實驗可知， 采用自歸一方法使儀器測量重復性好， 每次重新裝入樣品等操作因素引起的測量誤差基本可以忽略， 因此儀器使用方便， 適于現場快速檢測。

以添加三聚氰胺的純牛奶進行重復性檢測實驗。首先采用陰性純牛奶配制0～10 mg/kg標準系列， 擬合制作標準曲線， 擬合方程為：y＝0.488＋0.163x， 線性相關系數R2＝0.9956， 式中y為三聚氰胺濃度， x為自歸一信號。以相同陰性純牛奶配制2.5 mg/kg三聚氰胺樣品并分為10份， 分別進行10次測量， 所測自歸一信號的對標準偏差為2%; 回代濃度的相對標準偏差為5%。比較3組實驗數據可知， 對于液態奶樣品， 樣品基質干擾、增敏試劑反應后樣品均勻性及膠體反應動態特性等對測量有一定影響， 同時因誤差傳遞放大因素使回代濃度重復性有所劣化， 但完全可滿足快速檢測要求。

3.3 液態乳三聚氰胺檢測

分別對原奶、殺菌牛奶、固體純酸奶、奶粉實際樣品制作標準曲線， 標品濃度范圍0～30 mg/kg。圖6給出了儀器生成的原奶標準曲線。對于不同樣品擬合公式和擬合優度R2分別為原奶：y＝1.026＋0.557x， R2＝99.796%；

殺菌牛奶：y＝0.727＋0.165x， R2＝99.804；

固體純酸奶：y＝0.369＋0.176x， R2＝99.898%；

奶粉：y＝0.331＋0.029x， R2＝99.649%。

從擬合數據來看， 不同基質的擬合直線斜率和截距不同， 檢測靈敏度存在差異， 其中原奶斜率最大， 檢測靈敏度最高。從擬合公式、擬合優度參數可知， 在0～30 mg/kg范圍內， 儀器線性關系良好， 擬合優度均高于99%。

原奶樣品加入濃度為0.5， 1.0， 2.0和30.0 mg/kg三聚氰胺的回收率分別為81.0%， 113.5%， 108.5%和100.0%， 符合SN/T2805-2011《出口液態乳中三聚氰胺快速測定-拉曼光譜法》要求。

3.4 性能評價及應用

本儀器及配套檢測技術經不斷改進， 在2008～2010 年參加由科技部會同國家質檢總局、農業部、衛生部面向全國公開舉行的4次現場盲樣測試評價。在對優選出的4家單位進行最終測試評價中， 針對24個盲樣， 無假陰性， 無假陽性。評價結論為：檢測結果數據可靠， 方法可用。檢測結果詳見表1。

2011年首批定型儀器及配套技術在西藏質監局及全區下轄7個分支局得以初步應用， 在拉薩和海拔4500 m的高原地區（那曲）， 儀器能正常、有效工作， 性能穩定。此外儀器具備便攜式拉曼光譜儀的分析能力， 通過對軟件及算法的不斷完善， 本儀器還在食品安全檢測領域得到拓展， 例如， 橄欖油中摻假成分快速鑒別， 養殖水中孔雀石綠快速檢測和燃油快速鑒別等[8，9，15，16]。

References

1 Review Rules of Permitted Conditions for Enterprise Producing Dairy Products（企業生產乳制品許可條件審查細則）． 2010， http://www.aqsiq.gov.cn/zwgk/jlgg/ zjgg

2 Notic for Limited Value of Melamine in Food （《食品中三聚氰胺限量值公告》）， 2011， http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj /s7891

3 GB22388-2008， National Standard of P. R. China（中華人民共和國國家標準）， 2008

4 WANG Yi-Yin， YANG Qun， LI Chao-Zhen（王怡林， 楊 群， 李朝真）. Spectroscopy and Sepctral Analysis（光譜學與光譜分析）， 2004， 24（7）: 823～825

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6 LI Dong-Feng， WANG Hao-Jing， WANG Xin-Kui（李東風， 王浩靜， 王心葵）. Spectroscopy and Spectral Analysis（光譜學與光譜分析）， 2007， 27（11）: 2249～2253

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8 Zou M Q， Zhang X F， Qi X H， Ma H L， Dong Y， Liu C W， Guo X， Wang H. Agric. Food Chem.， 2009， 57: 6001～6006

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10 Tan Zhong-Qun（田中群）. China Basic Science（中國基礎科學），2001， 3:4～10

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13 Chinese Academy of Inspection and Quarantine （中國檢驗檢疫科學研究院）. Software Copyright（軟件著作權）， 2011， RN（登記號）：2011SR019640

14 LIU Feng， ZOU Ming-Qiang， LI Meng， ZHANG Cheng， YIN Feng（劉 峰， 鄒明強， 李 勐， 張 程， 尹 峰）． Chinese Invention Patent（國家發明專利）， 2011， 201110041184.2

15 Fessard， V.Godard， T.Huet， S， Mourot A， Poul J M. Applied Toxicology.， 1999， 19（6）: 421～430

16 FAN Xiao-Li， QI Xiao-Hua， ZOU Ming-Qiang， DONG Ying（范曉麗， 齊小花， 鄒明強， 董 英）. Acta Metrologica Sinica（Suppl.）（計量學報（增刊））， 2010， 31（5A）:1～4

Development of Portable Raman Spectrometer and

Its Application for Determination of Melamine

LIU Feng1， ZOU Ming-Qiang*1， ZHANG Xiao-Fang1， QI Xiao-Hua1，

FAN Xiao-Li1，2， DONG Ying2， ZHU Chao1

1（Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123）

2（School of Biological and Enviromental Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013）

Abstract A portable Raman spectrometer for melamine analysis was developed. The limit of quantitation was raised to 0.5 mg/kg by using surface-enhanced Raman scattering （SERS） technique. Using the relative measurement method， the instability of measurement was effectively improved. Experiments with raw milk， pasteurized milk， yoghourt， milk powder demonstrated that melamine concentration gradient showed good linearity with the spectrometer measured signal. The rapid inspection spectrometer had a good user interface and functions of analysis such as data collection， storage， classification， evaluation of the confidence level， RSD analysis. It was especially possible to have a rapid on-site testing with it's small size， portable， simple sample preparation requirements， the average detection time of single sample ＜2 min and the response time of instrument ＜30 s. The detection sensitivity， linear relationship and stability of the spectrometer were also good even though under extreme environment such as Tibet Lhasa and Naqu area that is an altiplano higher than 4500 m. The portable Raman spectrometer was also successfully used for the rapid authentication of olive oil and rapid detection of malachite green in fish farming water and other fields.

Keywords Melamine; Nano radiosensitizing; Surface enhancement; Raman spectrometry