血漿microRNAs在慢性肝損傷診斷中的應(yīng)用研究

江 梅綜述，萬(wàn)臘根審校

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

MicroRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性無(wú)編碼功能的小分子單鏈RNA，長(zhǎng)約21～23核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與機(jī)體各種重要的生理和病理過程。他們能夠與目標(biāo)mRNA的3＇-UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致蛋白翻譯的抑制或mRNA的降解[1]。當(dāng)它與mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)抑制蛋白翻譯的過程；而當(dāng)它與mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，則切割或降解mRNA[2]。有學(xué)者預(yù)計(jì)人類基因組中大約有800余個(gè)miRNA，雖占總編碼RNA基因數(shù)量的1%，但調(diào)控著人類基因組中約20%～30%的基因[3]，1個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)蛋白編碼mRNA，參與發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程[4，5]，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)和 凋亡、血細(xì)胞分化、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生和脂肪代謝等，隨著研究的進(jìn)展，對(duì)miRNA的研究從量的表象變化已經(jīng)慢慢過渡到作用機(jī)制，進(jìn)入了更深一步的研究。隨著檢測(cè)方法的進(jìn)步，一個(gè)新的領(lǐng)域—循環(huán) miRNA也逐漸成為科研的熱點(diǎn)，成為潛在的檢測(cè)標(biāo)志物和治療靶向點(diǎn)[6]。國(guó)內(nèi)外很多文獻(xiàn)指出血循環(huán)中的miRNAs在血漿和血清中非常穩(wěn)定，不易被RNase降解，在極端的pH和反復(fù)凍融等條件下仍能保持穩(wěn)定[7]。慢性肝損傷是一個(gè)多因素多階段的病變過程，導(dǎo)致慢性肝損傷因素有：肝細(xì)胞炎癥的變性壞死、肝纖維化、脂肪肝、肝硬變等等。慢性肝損傷發(fā)展后果多為形成肝硬化或肝癌，導(dǎo)致患者死亡。因此對(duì)慢性肝損傷病人的早期診斷尤為重要。由于miRNA的大小，數(shù)量，組織特異性，以及血漿中的相對(duì)穩(wěn)定性，因此miRNA將是診斷和監(jiān)測(cè)相應(yīng)特異組織損傷的分子生物學(xué)標(biāo)志物。本文就血漿miRNA在診斷慢性肝損傷中的應(yīng)用研究作一綜述。

1 血循環(huán)中m iRNA

肝臟組織細(xì)胞損傷、心肌細(xì)胞損傷等可導(dǎo)致某些特定循環(huán) miRNAS如 miR-122、miR-l及 miR-208a顯著升高[8]；結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等患者血漿或血清標(biāo)本中也存在一些表達(dá)水平明顯升高的循環(huán)miRNA[9]，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道外周血循環(huán)miRNAs主要來源于凋亡或壞死細(xì)胞的主動(dòng)釋放，以及循環(huán)細(xì)胞的裂解或是miRNAs被包裹在外核體中經(jīng)細(xì)胞分泌后釋放入外周血[10]，值得注意的是，在肝臟和血漿中共存在約93種miRNAS，其中67種可見于血漿中，55種可見于肝組織中，其中8種在所有人的肝組織中能檢測(cè)到，29種在所有人血漿中能檢測(cè)到，只有5種在所有人的肝組織和血漿中都能檢測(cè)到[11]，而miRNA在組織中高表達(dá)并不一定意味著血清中也高表達(dá)，Adaehi T等的檢測(cè)結(jié)果顯示miR574-3p和miR-146a在肝臟中的表達(dá)濃度也很高[12]，但未能進(jìn)一步驗(yàn)證二者在肝病患者血清中亦呈顯著高表達(dá)

2 血漿m iRNA與慢性肝炎

2.1 血漿miRNA與病毒性肝炎

我國(guó)是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū),尤其是慢性乙型肝炎，僅人群HBV感染率就高達(dá)60%，HBV攜帶者約1.2億人，其中約20%的HBV感染者可能發(fā)展成為慢性乙型肝炎 (chronic hepatitis B，CHB)，CHB已成為我國(guó)最廣泛、最嚴(yán)重的傳染病。 從已經(jīng)發(fā)表的miRNAs 表達(dá)譜數(shù)據(jù)中：miR-199a、miR-126、miR-181a、miR-122、miR-21、miR-223、miR-125b、miR-222和miR-150等與肝臟病變相關(guān)，其中在肝臟組織中有較高表達(dá)水平的miRNAs有 miR-122、miR-126、miR-125b；原發(fā)性肝癌組織中上調(diào)或下調(diào)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNAs有 miR-21、miR-125b、miR-223、miR-199a、m iR-222； 以及與病毒復(fù)制有關(guān)的 miRNAs有 miR-150、miR-181a[13-16]。賈音[17]等測(cè)定了這些miRNAs在慢性乙型肝炎肝損傷患者血漿樣本中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述與肝病相關(guān)的9個(gè) miRNAs有 3個(gè)(miR-199a、miR-125b和 miR–122)，其血漿中的表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中miR-122的變化最為顯著。桂俊豪[18]等選擇5種可能與肝病相關(guān)循環(huán)miRNAs(miR-885-5p，miR-215，miR-224，miR-574-3p和miR-146a)作為候選分子進(jìn)行了初步驗(yàn)證，經(jīng)過兩次獨(dú)立樣本驗(yàn)證，最終結(jié)果顯示，CHB患者血清中miR-885-5p的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照(P<0.01)，可能是由于機(jī)體免疫細(xì)胞可能存在持續(xù)的抗病毒活性并由此導(dǎo)致免疫細(xì)胞內(nèi)源性miR-885-5p進(jìn)入外周血。Xu[19]等用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)48例慢性乙肝患者及101例肝癌患者血清中的miR-21miR-122miR-223，結(jié)果與健康人相比明顯升高，且乙肝患者升高趨勢(shì)要比肝癌患者明顯，因此 miR-21，miR-122，miR-223 可作為慢性乙型肝炎肝損傷新的分子生物學(xué)標(biāo)志。

2.2 血漿miRNA與酒精性肝炎、藥物性肝炎

慢性肝炎不但包括慢性病毒性肝炎，還包括酒精性肝炎、藥物性肝炎等等，酒精性肝損害主要是肝細(xì)胞氧化損傷，嚴(yán)重時(shí)可以誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死。在西方國(guó)家，酗酒是發(fā)生慢性肝炎的首要原因，而酒精性肝損傷導(dǎo)致的酒精性肝硬化占肝硬化病人的一半以上。藥物性肝病是由于藥物治療過程中肝臟受藥物本身、代謝產(chǎn)物損害或發(fā)生過敏反應(yīng)所致。其危害包括肝臟血管損害、誘導(dǎo)肝癌和促使肝硬化等[20]。在全球所有藥物不良反應(yīng)中，藥物性肝病發(fā)生率為3%～9%[21]，Zhang[22]等建立了兩種肝損傷小鼠模型(D-胺基半乳糖和酒精所致的肝損傷模型)來評(píng)估肝損傷，在D-胺基半乳糖所致的肝損傷模型中，早在腹腔注射0.5h后，就有血漿miR-122的增高，而且所有的小鼠均出現(xiàn)肝臟損傷的病理學(xué)變化，但是在此時(shí)間點(diǎn)，ALT的活性并沒有發(fā)生改變。酒精所致的肝損傷模型與D-胺基半乳糖所致的肝損傷模型檢測(cè)結(jié)果基本一致。而不同的是酒精所致的肝損傷模型中，0.5h并沒有發(fā)現(xiàn)小鼠的肝臟有組織病理學(xué)改變，在酒精灌胃更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)才有了肉眼可以觀察到的病理學(xué)改變。與常規(guī)標(biāo)志物ALT相比，在檢測(cè)這些類型的肝臟損傷時(shí)，miR-122可能是一個(gè)更加靈敏的指標(biāo)，因?yàn)閙iR-122的表達(dá)水平改變可能還更先于肉眼可見的組織病理學(xué)變化。Wang[11]等發(fā)現(xiàn)藥物(對(duì)乙酰氨基酚)直接損傷肝細(xì)胞時(shí)大鼠血漿中循環(huán)miRNAs的表達(dá)譜發(fā)生明顯變化，miR-192、miR-122在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的血漿及肝組織中也極大不同，其中miR-122可急劇升高400倍以上，而miR-710和miR-711的表達(dá)則明顯下調(diào)。因此，循環(huán)miRNAS有望成為一類監(jiān)測(cè)酒精性肝炎、藥物性肝炎新型生物標(biāo)志物。

3 血漿m iRNA與肝纖維化、肝硬化

肝纖維化是各種原因包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、中毒性肝病、自身免疫性肝病等導(dǎo)致肝臟損害后的一種修復(fù)過程,其結(jié)局是形成肝硬化,成為消化內(nèi)科常見的難治疾病[23-24]。肝纖維化發(fā)生機(jī)制還未完全明了，肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化發(fā)生的早期關(guān)鍵事件，但最基本的細(xì)胞事件不外乎是細(xì)胞分化、增生和凋亡。 而這些正是miRNAs所調(diào)節(jié)的.Ji[25]發(fā)現(xiàn) miR-27a、miR-27b 在肝星狀細(xì)胞激活后明顯上調(diào)，此外上調(diào)的還有miR-30a、miR-30c、miR-30d。miR-29a、miR-29b 表達(dá)下調(diào)也參與肝星狀細(xì)胞激活[26]。至于肝纖維化過程中血漿microRNAs表達(dá)水平未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。在其發(fā)展為肝硬化后患者血漿中的microRNAs表達(dá)水平已有學(xué)者作出了驗(yàn)證。Gui[27]等發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清中miR-122的濃度較健康對(duì)照高了5.2倍，miR-192的濃度相應(yīng)升高8.9倍，而血清中miR-885-5P的表達(dá)水平較健康組分別升高8.8倍(P＜0.01)，血清中miR-146a和miR-224的水平明顯高于健康組(P＜0.05 和 P＜0.01)，而 miR-574-3p 的表達(dá)水平在健康組和肝硬化組未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，miR-215的檢出率太低而未作統(tǒng)計(jì)分析。因此，循環(huán)miR-122、miR-192、miR-885-5p 有望成為一類監(jiān)測(cè)肝硬化的新型生物學(xué)標(biāo)志物。

4 循環(huán)m iRNA檢測(cè)

目前循環(huán)miRNA檢測(cè)方法主要有：高通量測(cè)序法(Illumina/Solexa)、微陣列法、Northern blot法和熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)法。目前也研究出了一些在此基礎(chǔ)上的改良方法。如：LNA的探針雜交技術(shù)，核糖核酸酶保護(hù)法 (RNase protection assay，RPA)，微陣列芯片技術(shù)(Microarray)等。 循環(huán)miRNA表達(dá)與定量檢測(cè)最常用的方法是 qRT-PCR法，此方法操作快速、簡(jiǎn)便、高效，而且具有很高的敏感性和特異性。目前miRNA檢測(cè)的qRT-PCR方法主要是基于莖-環(huán)的RT-PCR方法 (stem-loop RTPCR)和基于 poly(A)加尾的RT-PCR方法。莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法的優(yōu)勢(shì)主要在于其反轉(zhuǎn)錄特異性較高，可反轉(zhuǎn)錄出與目的miRNA互補(bǔ)的一條或幾條miRNA的cDNA第一鏈，然后通過特異的正向引物進(jìn)行后續(xù)的熒光定量PCR檢測(cè)。此法特異性強(qiáng)，但是引物設(shè)計(jì)較為繁瑣和困難。加尾法反轉(zhuǎn)錄幾乎將所有的成熟的miRNA加上Poly(A)的尾巴后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。通過特異的正向引物進(jìn)行后續(xù)的熒光定量PCR檢測(cè)，此法引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，通用性好。

5 展望

microRNAs(miRNAs)作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因，參與機(jī)體的各種重要的生理和病理過程。在不同生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下，miRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯變化。目前，對(duì)于組織損傷后，循環(huán)中特異性的miRNA的研究并不多，研究并構(gòu)建不同病理生理狀態(tài)下循環(huán)miRNAS表達(dá)譜，對(duì)于疾病診斷、療效判斷及預(yù)后評(píng)估等無(wú)疑更具有吸引力[28]。檢測(cè)循環(huán)中的miRNAs作為一種創(chuàng)傷性小，快速，簡(jiǎn)便的診斷方法，隨著技術(shù)的成熟，想必將來會(huì)廣泛地應(yīng)用于臨床診斷，尤其是監(jiān)測(cè)早期的特異性的組織損傷。雖然不同疾病相關(guān)循環(huán)miRNA的種類、產(chǎn)生機(jī)制和作用還不完全清楚，但相信隨著RNA、DNA和蛋白質(zhì)三大生物分子學(xué)研究的深入，將會(huì)很好地解決這些還未明確的問題，為疾病的預(yù)測(cè)、診斷和治療效果的監(jiān)測(cè)開辟更廣闊的前景。

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