G250基因沉默對腎癌 786-0細胞增殖和細胞周期的影響

趙俊峰 鄭少斌 姜耀東 楊旭凱 肖耀軍

(河南省中醫院 河南中醫學院第二附屬醫院泌尿外科,河南 鄭州 450002)

腎癌發生發展的分子機制研究中,G250是公認的腎透明細胞癌腫瘤相關抗原,但 G250基因在腎透明細胞癌發病中的作用尚不明確,多數研究結果顯示G250基因可能是一種癌基因〔1〕,并且參與了腎腫瘤細胞的生長與轉移〔2〕。為進一步了解該基因在腎癌發生、發展中的作用,本實驗利用RNA干擾技術阻斷 G250基因表達,觀察了沉默 G250基因對腎癌 786-0細胞體外增殖及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人腎透明細胞癌 786-0細胞株(以下稱腎癌 786-0細胞)及大腸桿菌(DH5α)由南方醫科大學南方醫院泌尿外科保存。胎牛血清及 RPMI1640培養基(美國GIBCO公司),0.25%胰蛋白酶、碘化丙錠(PI)、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國 Sigma公司),二甲苯、多聚甲醛、檸檬酸鈉、蘇木素(成都化學試劑廠)。Biol-Rad酶聯免疫檢測儀(德國 BioRad公司),ELITE流式細胞儀(美國BECKMAN-COULTER公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建及siRNA轉染 G250 mRNA的全長序列從 NCBI基因庫(登錄號:AJ010588)檢索得出。應用Primer express軟件按照siRNA設計原則尋找含 21個堿基的特異性序列,根據p RNAT-U6.1/Neo質粒的結構,設計出特異性干擾片段的核苷酸序列,并構建重組質粒(命名為pshRNA-G250)。在前期實驗的基礎上,選擇二條最有效的G250的siRNA片段,靶位點 970-990和 293-313。腎癌 786-0細胞培養時培養基為含 10%胎牛血清的 RPMI1640,置 37℃,95%飽和濕度,體積分數為 5%的 CO2培養箱中培養。轉染前 24 h,傳代至 24孔板,每孔 1.5×105個細胞。依說明書用 LipofectamineTM2000轉染。轉染后 6 h換成完全培養基繼續培養。

1.2.2 轉染后腎癌 786-0細胞體外增殖實驗 將轉染后的 4組細胞(si-G250-a、si-G250-b、轉染陰性對照和空質粒,分別命名為 786-0/si-G250-a、786-0/si-G250-b、786-0/si-G250-n和 786-0/si-G250-0),用 0.25%胰蛋白酶消化后用含 10%胎牛血清培養液配成單個細胞懸液,調整細胞濃度為 50 000個細胞/ml,以每孔 100μl接種到 96孔板,同時設置空白孔調零,以只加培養液不加細胞做比色對照。培養 12 h后,每孔加培養液補齊至100μl。終止培養前 4 h,每孔加 20μl 5 mg/ml的四氮唑藍鹽(MTT)溶液,在磁力攪拌器上混勻 30 min,繼續孵育 4 h,整個培養板上離心機,配平后開始低速離心 3 000 r/min,10 min后取下,小心吸棄孔內培養上清液。每孔加 100μl DMSO,室溫孵育 10min,微振蕩器振蕩 15 min,使結晶物充分溶解,用 Biol-Rad酶聯免疫檢測儀在 570 nm測光密度值(OD值)。每組設 3個重復孔,取平均值,以時間為橫坐標,OD值為縱坐標繪制重組質粒轉染 786-0細胞 1～7d后的細胞生長增殖曲線。

1.2.3 流式細胞術分析細胞周期 取生長狀態良好的轉染72 h后的轉染空質粒及 pshRNA-G250-b(干擾效率最高)腎癌786-0細胞(分別命名為 786-0/si-G250-0和 786-0/si-G250-b細胞),待細胞密度達 80%～90%時,0.25%胰酶室溫消化,臺盼藍拒染法計數細胞,使收集細胞總數約 1×106,1 000 r/min,離心 10min,用冷 PBS洗兩次,緩慢加入 -20℃預冷的 70%乙醇1.5ml固定細胞,充分震蕩,使細胞分散,4℃保存待測。上機測定前離心去乙醇,用 PBS洗兩次,加 100μg/ml RNase 200μl,37℃消化 30 min。 PI 50μg/ml染色 30min,ELITE.流式細胞儀 488 nm激發波長、功率 15mW測定,用美國 PHEONIX公司的 Multicycle軟件分析細胞周期的分布,最后計算出細胞各期的百分數。

1.3 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件進行處理,數據均以±s表示,細胞周期變化兩組均數間的比較用兩獨立樣本 t檢驗,細胞體外增殖實驗采用重復測量數據的方差分析。

2 結 果

2.1 G250基因表達沉默對腎癌 786-0細胞體外增殖能力的影響 經重復測量數據的方差分析,四組之間差異顯著(F=360.170,P=0.000),多重比較得出四組細胞兩兩之間的差異除空白組和陰性組比較無統計學意義(P=0.263),其余各組均有統計學意義。這些結果說明 G250表達水平降低后,腎癌786-0細胞的體外增殖能力受到抑制。見圖 1。

2.2 流式細胞術分析細胞周期 Multicycle軟件分析 786-0/si-G250-0和 786-0/si-G250-b細胞流式細胞儀檢測細胞周期的分布,轉染干擾載體的 786-0/si-G250-b細胞較轉染空質粒的786-0/si-G250-0細胞的細胞周期分布發生較大變化,其主要改變表現為 G250基因表達降低后 G0/G1期細胞增多,而 S期、G2/M期細胞則減少。說明 G250基因表達降低后腎癌 786-0細胞出現了細胞周期的 G0/G1期阻滯。見表 1,圖 2。

圖1 實驗各組細胞體外MTT法增殖能力比較(OD值)

表1 流式細胞術分析 786-0/si-G 250-0和786-0/si-G 250-b細胞周期(±s,n=3,%)

表1 流式細胞術分析 786-0/si-G 250-0和786-0/si-G 250-b細胞周期(±s,n=3,%)

細胞系 G0/G1 S G2/M 786-0/si-G250-0 44.73±2.29 41.27±1.21 14.00±1.08 786-0/si-G250-b 59.97±3.26 32.83±2.73 7.17±1.40 t值 6.620 4.889 6.676 P值 0.003 0.008 0.003

圖2 流式細胞術分析 786-0/si-G250-0和786-0/si-G 250-b細胞周期分布

3 討 論

本實驗研究表明 G250基因表達沉默后,腎癌 786-0細胞體外增殖能力明顯減低,提示G250基因在促進細胞增殖、轉化方面有重要的作用〔1,3〕。體外細胞的增殖實驗發現 G250基因表達沉默后,不僅腎癌786-0細胞體外增殖能力下降,而且隨著時間的延長表現出與對照組細胞體外增殖能力差異的加大,說明選擇 pRNAT-U6.1/Neo質粒作為載體構建siRNA重組體的干擾效果穩定。

資料顯示,惡性腫瘤細胞的基因表達和功能異常往往伴隨著廣泛的細胞周期調節失控,導致細胞分化受阻,使腫瘤細胞呈過度增殖狀態〔4〕。在細胞周期中,有 G0/G1、G1/S和 G2/M 3個調控點影響細胞周期,尤其是 G1→S期、G2→M期轉化過程,可使細胞周期停止,抑制細胞增殖,進入細胞周期的細胞也可發生凋亡而離開細胞周期。其中 G1調控點的存在可防止用損傷的DNA作為模板進行DNA復制,允許損傷的DNA在關鍵的細胞功能發生改變之前修復,可增加細胞存活時間,限制帶有可遺傳的基因損傷的細胞增殖〔5〕。因此凡是影響腫瘤細胞增殖的作用都存在細胞周期的變化。本實驗發現,G250基因表達降低后 G0/G1期細胞增多,而 S期、G2/M期細胞減少。說明G250基因表達沉默可以導致腎癌 786-0細胞G0/G1期阻滯,降低腎癌 786-0細胞 DNA的合成,從而抑制細胞生長和增殖,提示 G250基因與腎癌細胞的生長和增殖呈正相關。

多項研究發現在細胞周期的調控體系中,有多種因子參與,其中細胞周期蛋白的周期特異性、時相特異性積累與分解是確保周期有序變更的基礎〔6〕,包括 cyclin D1和 cyclin E1在G0/G1至 S期轉換中都起主要作用〔7,8〕,它們在 G1期進入 S期時高表達,與腫瘤細胞侵襲力、轉移密切相關〔9〕。因此可以推斷 G250基因表達沉默影響細胞周期阻滯在G1期的主要機制可能是下調 cyclin D1的表達,從而阻滯腎癌 786-0細胞 G0/G1期至S期的進程,抑制了細胞增殖。而很早以前的研究就已經發現 G250的cDNA轉染到小鼠的 NIH3T3成纖維細胞中可使細胞周期縮短,DNA合成增多〔10〕。所以真正的機制還有待進一步探討。

1 Zavada J,Zavadova Z,Pastorek J,et al.Human tumor-associated cell adhesion protein MN/CA IX:identification of M75epitope and of theregion mediating cell adhesion〔J〕.Br J Cancer,2000;82(11):1808-13.

2 Cho M,Uemura H,Kim SC,et al.Hypomethylation of the MN/CA9 promoter and upregulated MN/CA9 expression in human renal cell carcinoma〔J〕.Br JCancer,2001;85(4):563-7.

3 Mc Kiernan JM,Buttyan R,Bander NH,et al.Expression of the tumor-associated gene MN:a potential biomarker for human renal cell carcinoma〔J〕.Cancer Res,1997;57(12):2362-5.

4 劉秉文,陳俊杰.醫學分子生物學〔M〕.北京:中國協和醫科大學出版社,2000:221-37.

5 Zhang J,Hua ZC.Targeted gene silencing by small interfering RNA-based knock-down technology〔J〕.Curr Pharm Biotechnol,2004;5(1):1-7.

6 Bahnassy AA,Zekri AR,Alam El-Din HM,et al.The role of cyclins and cyclins inhibitors in the multistep process of HPV-associated cervical car-cinoma〔J〕.J Egypt Natl Canc Inst,2006;18(4):292-302.

7 Stacey DW.Cyclin D1 serves as a cell cycle regulatory switch in actively proliferating cells〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2003;15(2):158-63.

8 Shariat SF,Ashfaq R,Sagalowsky AI,et al.Association of cyclin D1and E1expression with disease progression and biomarkers in patients with non-muscle-invasive urothelial cell carcinoma of the bladder〔J〕.Urol Oncol,2007;25(6):468-75.

9 Nauman A,Turowska O,Poplawski P,et al.Elevated cyclin Elevel in human clear cell renal cell carcinoma:possible causes and consequences〔J〕.Acta Biochem Pol,2007;54(3):595-602.

10 Pastorek J,Pastorekova S,Callebaut I,et al.Cloning and characterization of MN,a human tumor-associated protein with a domain homologous to carbonic anhydrase and a putative helix-loop-helix DNA binding segment〔J〕.Oncogene,1994;9(10):2877-88.